柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠海马调节HPA轴功能的影响*

樊蔚虹，禹 方，姚建平

(河南中医学院，郑州 450046)

柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠海马调节HPA轴功能的影响*

樊蔚虹，禹 方，姚建平

(河南中医学院，郑州 450046)

目的:研究柴胡疏肝散对慢性应激模型大鼠海马调节HPA轴功能的影响。方法:采用慢性不可预见性刺激制造慢性应激大鼠模型，分别用Western bolt法和Elisa法检测各组大鼠海马MR和GR及下丘脑CRH蛋白的表达，检测血浆ACTH和血清CORT含量。结果:治疗组大鼠海马GR蛋白表达明显增高，下丘脑CRH蛋白表达及血浆ACTH和血清CORT的含量明显降低。结论:柴胡疏肝散能够抑制慢性应激所致的大鼠HPA轴功能的亢进，其机制可能与调节大鼠海马GR蛋白表达、进而发挥对HPA轴功能的抑制作用有关。

柴胡疏肝散;海马;GR;MR;HPA轴

抑郁症是一种严重危害人类身心健康的疾病。近年来，抑郁症的发生、发展、预防及治疗引起学者们越来越广泛的关注，但其发病机制仍不明确。本实验采用慢性不可预见性刺激制造抑郁大鼠模型，用疏肝解郁代表方柴胡疏肝散为治疗方剂，从慢性应激模型大鼠海马调节HPA轴功能的角度探索抑郁症的发病机制和柴胡疏肝散的治疗机理。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级SD雄性大鼠，5～6月龄，体质量(300± 20)g共30只，由河南省实验动物中心提供(许可证号:SCXK(豫)2010-0002)。大鼠普通饮食、自由饮水(造模时禁食、禁水应激刺激除外)，室温18～25℃(造模时冷应激刺激除外)，相对湿度60% ～70%，自然昼夜节律光照。

1.2 药物

参照中国中医药出版社中《中医方剂学》第七版教材中柴胡疏肝散:柴胡6 g，陈皮6 g，川芎4.5 g，香附4.5 g，枳壳4.5 g，白芍4.5 g，炙甘草1.5 g。均按原方比例熬制，使其终浓度为1 g/ml。

1.3 仪器与材料

蛋白垂直电泳系统(BIO-RAD公司)，图像分析系统(北京天地公司)，酶标仪:1510-00441C;GR、MR和CRH多克隆抗体及二抗(Santa cruz)，大鼠促肾上腺皮质激素ELISA试剂盒、大鼠皮质酮ELISA试剂盒(美国R＆D)。

1.4 动物分组

实验大鼠适应性喂养1周，每日触摸大鼠2 min，以使大鼠能适应实验操作，将大鼠按随机数字表法分为柴胡疏肝散组、抑郁模型组、正常对照组3组各10只。

1.5 抑郁模型制备

动物模型的制备采用经典的慢性不可预见性应激方法(chronic unpredictable stress，CUS)，根据文献［1］做出部分修改。应激包括冰水游泳(4℃，3 min)、热水游泳(55℃，3 min)、束缚4 h、摇晃(每次3 min)、夹尾(每次15 s共3 min)、禁水24 h、禁食24 h、剥夺睡眠12 h共8种刺激，每日随机选取1种刺激方法，使动物不能预料刺激的发生，以达到制备慢性应激大鼠的目的。在整个实验中，每种刺激应用1～3次。

1.6 给药方法

柴胡疏肝散组大鼠按生药量7.875 g/(kg·d)灌胃，相当于成人(60 kg)临床用量的15倍。从应激刺激开始灌胃至应激结束止，共用药21 d。正常对照组及抑郁模型组给予同等剂量的生理盐水。

1.7 Western-Blot法检测海马MR、GR和下丘脑CRH的蛋白表达

10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，用消毒手术器械取海马及下丘脑，分置于高压蒸汽灭菌的EP管中，100 mg组织中加入RIPA裂解液900 μL，冰浴匀浆，加入100 μL PMSF(0.1 μL)液，转移至1.5ml离心管中并加入40 μL complete(10 μg/μL)液，离心(4℃，10000 r/10 min)，取上清分装，－70℃保存。考马斯亮蓝法测定蛋白含量，各组样品入沸水3～5 min变性，取等量样品做SDS-PAGE凝胶电泳(电压120V)。电泳结束后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(0.22 μm的NC膜，4℃，电压100 V，转膜3 h)。丽春红预染NC膜，PBS洗净，5%脱脂牛奶封闭1.5h，再将膜转移至加有2 ml 1∶200稀释的兔抗大鼠一抗杂交袋中，37℃摇床孵育3.5 h，PBST洗膜6×5 min，转移至加有2ml 1∶5000稀释的山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗杂交袋中，37℃摇床孵育1.5 h，PBST洗膜×5 min。加入化学发光剂反应5 min，保鲜膜包裹，暗室X线胶片曝光、显影和定影。Western blot条带经凝胶成像分析系统扫描处理，计算各目的带光密度值，将各组的光密度值与对照组比较，得到相对百分数。

1.8 大鼠血液标本采集及ACTH和CORT的测定

造模结束后，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主动脉采血(每只鼠均取抗凝、促凝2管血)，3000 r离心15 min，取血浆及血清分装，－70℃保存。严格按照试剂盒说明进行大鼠血浆ACTH和血清CORT含量的检测。

1.9 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行t检验及方差齐性检验，定量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 柴胡疏肝散对各组大鼠海马GR和MR、下丘脑CRH蛋白表达的影响

表1显示，与正常对照组比较，抑郁模型组大鼠海马GR蛋白表达明显降低(P＜0.05);与模型组比较，柴胡疏肝散组大鼠海马GR蛋白表达明显升高(P＜0.05)，各组间MR蛋白表达水平比较差异无统计学意义。与正常对照组比较，抑郁模型组大鼠下丘脑CRH蛋白表达明显增高(P＜0.05);与模型组比较，柴胡疏肝散组大鼠下丘脑CRH蛋白表达明显降低(P＜0.05)。

表1 各组大鼠海马GR和MR、下丘脑CRH蛋白表达(±s)

表1 各组大鼠海马GR和MR、下丘脑CRH蛋白表达(±s)

注:与正常对照组比较:▲P＜0.05;与抑郁模型组比较:*P＜0.05

组 别 例数 剂量(g/kg/d) GR (OD值) MR (OD值) CRH (OD值)正常对照组 3 —0.647±0.061 0.482±0.015 23.933±0.222抑郁模型组 3 —— 0.404±0.003▲0.485±0.014 45.847±0.655▲柴胡疏肝散组 3 7.875 0.627±0.005* 0.473±0.009 34.292±0.315*

2.2 柴胡疏肝散对各组大鼠血浆ACTH与血清CORT含量的影响

表2显示，与正常对照组比较，抑郁模型组大鼠血浆 ACTH与血清 CORT含量明显增高(P＜0.05);与模型组比较，柴胡疏肝散组大鼠血浆ACTH与血清CORT含量明显降低(P＜0.05)。

表2 各组大鼠血浆ACTH与血清CORT含量(±s)

表2 各组大鼠血浆ACTH与血清CORT含量(±s)

注:与正常对照组比较:▲P＜0.05;与抑郁模型组比较:*P＜0.05

组 别 例数 剂量(g/kg/d) ACTH(ng/ml) CORT(ng/ml)正常对照组 10 —22.341±1.882 8.664±0.604抑郁模型组 10 — 44.304±2.576▲13.945±0.880▲柴胡疏肝散组 10 7.875 29.185±2.367*10.195±0.541*

3 讨论

HPA轴是神经内分泌系统的重要组成部分，下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放素(CRH)作用于垂体，调控垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)的分泌，ACTH又可作用于肾上腺皮质，影响HPA轴最终产物皮质醇(哺乳动物为皮质酮)的分泌，由此构成了由上到下的顺行调控。

近年来神经内分泌学的研究发现，抑郁症发病常伴有下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)功能的改变。若机体长期处于应激状态，HPA轴功能持续亢进，将严重影响其身心健康，使机体出现抑郁症状［2-3］。拟皮质醇药物能诱发抑郁，抗皮质醇药物能缓解抑郁症，说明HPA轴功能亢进可能与抑郁症的发病过程相关。Watson等［4-5］在研究中发现，抑郁症患者脑脊液(CSF)中CRH浓度增高，且经过治疗后，CSF中原先升高的CRH浓度比治疗前有所降低，推测CSF中CRH浓度升高可能是抑郁症的状态标志或是可以作为抑郁症早期复发的预测因子。蔡莉［6］研究发现，CUMS模型大鼠下丘脑CRHmRNA表达显著增高，表明抑郁模型大鼠存在CRH功能亢进。另有研究证明［7-8］，动物和人类在抑郁状态时血浆ACTH水平较高，且抑郁症患者病情程度与血浆ACTH水平密切相关［9］，经抗抑郁药治疗后血浆ACTH趋于正常化。CORT是HPA轴的终末激素，研究发现抑郁模型小鼠血清CORT明显高于正常对照组［10］。抑郁症患者的血浆皮质醇水平增加，尿游离皮质醇排泄也增加［11］，抑郁缓解后皮质醇的浓度下降［12］。

海马作为边缘系统的重要组成部分，为HPA轴负反馈调节的重要组成部分［13］，糖皮质激素受体(GR)和盐皮质激素受体(MR)在这一负反馈调节中发挥重要作用。研究表明，慢性应激模型大鼠海马GRmRNA表达明显下降［14-15］，抑郁症患者存在GR数量的下降，造成糖皮质激素对HPA轴负反馈作用的减弱，使HPA轴功能更加亢进，形成恶性循环［16-17］。刘丽琴［18］等研究也发现，抑郁大鼠海马GRmRNA表达显著降低，但各组间MRmRNA表达水平比较差异无统计学意义。

中医无“抑郁症”一名，但根据其临床表现，认为它与“百合病”、“脏躁”、“梅核气”等情志疾病相似，故将其命名为“郁证”。认为郁证的发生多是由于情志所伤、肝气郁结，逐渐引起五脏气机失和所致，故治疗应以疏肝解郁为大法。大量研究显示［19-21］，疏肝解郁法对抑郁症时HPA轴功能亢进有显著调节作用。作为疏肝解郁的经典方，柴胡疏肝散及其提取物均可拮抗慢性应激诱导的HPA轴功能亢进，从而起到抗抑郁作用［22］。本实验中慢性应激大鼠海马GR蛋白表达明显降低，下丘脑CRH表达及血浆ACTH、血清CORT含量水平明显升高，提示在慢性应激状态下大鼠海马损伤对HPA轴负反馈调节作用减弱，HPA轴功能亢进，释放大量相关激素参与调控应激反应，而过多的CRH、ACTH及CORT又进一步破坏HPA轴的平衡。采用柴胡疏肝散对慢性应激抑郁模型大鼠进行干预，发现柴胡疏肝散可明显增加抑郁模型大鼠海马GR蛋白的表达，降低抑郁模型大鼠下丘脑 CRH以及血浆ACTH、血清CORT水平。因此，通过海马调节HPA轴功能亢进可能是柴胡疏肝散治疗抑郁症的机制之一。

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R749.4

B

1006-3250(2015)01-0050-03

2014-08-19

河南省高等学校青年骨干教师资助计划(2011GGJS-092)-柴胡疏肝散对抑郁症大鼠海马调控HPA轴作用机理研究

樊蔚虹(1957-)，女，安徽庐江人，教授，医学学士，从事中医常见证候的规范化研究。