高职生物化学“肝中酮体的生成作用”实验的教学

诸戌娴

(无锡卫生高等职业技术学校 江苏无锡 214000)

在药学、药物分析技术和生物制药技术组成的药学专业群中，生物化学是一门重要的专业基础课。而在以就业为导向，以提升学生实践能力为主要目标的高职学校中，如何上好这门专业基础课的实验教学课就显得尤为重要[1]。

“肝中酮体的生成作用”是与脂类代谢中脂肪酸分解氧化章节相对应的一个验证性实验[2]，学生能否规范合格的操作和严谨细致的思考，往往影响着实验成效。

1 讲清原理，让学生明明白白做实验

除了成熟红细胞和脑组织外，几乎所有组织都能氧化利用脂肪酸，通过活化、穿梭、β-氧化生成乙酰辅酶A，最终彻底分解为二氧化碳、水和大量能量。而在肝细胞内β-氧化生成的乙酰辅酶A则大部分缩合生成乙酰乙酸(70%)、β-羟丁酸(30%)和丙酮(含量极少)，三者合称酮体。酮体生成酶只存在于肝细胞内，所以本实验就利用组织对比法，将肝匀浆和其他组织匀浆分别与丁酸底物保温，底物和酮体生成酶在适宜的条件下将生成酮体，而酮体能使白色的显色粉转变成紫红色，因此可利用显色反应，对各组合进行对比分析，验证“肝为酮体生成器官”这一理论。

理论上只有既存在底物丁酸，又存在肝匀浆(酮体生成酶系)的这支试管显色，但是根据多年实践操作，结果并非如此。因为我们不能忽视酮体“肝内生酮，肝外利用”这一代谢特点，也就是说根据机体状况，各组织器官其实都有可能出现酮体。肝内组织有已经合成但还没有运出去的酮体，肝外组织有还未开始分解利用的酮体。所以为了指导学生对稍后实验结果给出更全面，更科学地分析，讲实验原理时一定会提醒酮体的代谢特点，帮助学生拓展思路。

2 规范操作，鼓励学生边做边思考

2.1 制备组织匀浆

本实验选取的是猪肝和猪的肌肉作为组织对比材料。为了提高学生的实验参与度，掌握实验各环节的操作要点，学生需要自己用研钵将两个组织分别研磨直到细胞破碎，释放出胞内酶和其他物质。在教学中强调学生必须养成高度的责任心和严谨的科学态度，如果研磨不彻底，细胞将不能释放出酶，后续实验都无法顺利进行，所以这是实验成功的第一步。

2.2 酮体生成反应

本实验为定性实验，按下表用滴管分别滴加四支试管即可。在此步骤中学生最容易犯的错误是滴管混用，吸完一种试剂不清洗干净或新换一个滴管，就直接吸取下一种试剂，尤其是吸取肝匀浆和肌匀浆时，这将引起较大显色误差。另外试剂全部滴加完后未认真混匀，也是常见的问题，这将影响酮体的生成量。

2.3 显色反应

37度保温后，各管滴加15%三氯醋酸20滴(用途：终止酮体生成酶活性)，混匀，静置5 min备用。同时取白瓷反应板，在4个凹槽中各加入等量显色粉，随后分别用干净吸管从四支试管中，吸取适量试剂滴加于显色粉，最后观察各管的颜色变化。本步骤需注意白瓷反应板各孔的显色粉量尽量一致，并且显色粉中有少量亚硝基铁氰化钠，有一定毒性，需提醒学生提高安全意识，谨慎操作。其次滴加试剂的滴管必须滴一次，洗一次或换一次，以免干扰正确结果。同时滴加的量只要使显色粉湿润即可，而每组自行添加的显色粉量不一定相同，所以需要每一组学生在滴加第一孔显色粉时，做简单摸索，确定需要滴几滴试剂才能达到要求，随后几管试剂可照此操作。

2.4 结果与分析

因为在讲解原理时已经为学生拓展过思路，所以分析实验结果时，认真听课、勤于思考的学生完全可以自行分析，而学习能力较弱的学生，通过老师引导，也能说出实验现象的成因。一号管含肝匀浆和丁酸，显色最深，因为此管中既有新生成的酮体，又可能存在肝中本就合成却没有运输出去的酮体。二号管含肝匀浆，显色较一号管浅，比其他管深，虽然没有底物，不能合成新的酮体，但是应该存在肝中合成却没有运输出去的酮体，故仍然能使显色粉显色。三号管只含底物丁酸，因为缺乏酮体生成酶，所以既不能新生成酮体，也不含组织内已有的酮体，完全不显色。四号管含丁酸和肌匀浆，虽然不能生成新的酮体，但是存在组织内早已转运进来，但尚未用完的酮体，所以也会浅浅的显色。通过阴性对照、阳性对照、组织对比和比色法，此实验即验证了肝中酮体的生成作用，又进一步体现了酮体的代谢特点，可谓一举两得。

3 总结

“肝中酮体的生成作用”虽然是一个验证性实验，但是面对学习能力较弱的高职学生，必须仔细透彻地将本章节相关理论知识一一讲解清楚，使前后知识融会贯通。同时，在实验教学中根据不断积累的经验和实际结果，要求学生处理好每一个操作细节和关键步骤，养成高度的责任心，培养解决问题的能力和分析问题的能力。针对此次实验结果还可以鼓励学生分析实验方案中的优缺点，提出改进措施，从而培养学生的探索精神和创新精神。总之，实验教学既要锻炼学生的动手能力，也要锻炼动脑能力，学会分析问题，解决问题。

[1] 汪燕芳.生物化学实验教学改革与实践[J].实验室科学，2017,20(1)：91-93

[2] 刘家秀.生物化学[M].北京：科学出版社，2015