植物油脂肪酸甲酯化方法比较与含量测定

伍新龄，王凤玲，*，关文强

（1.天津市食品生物技术重点实验室，天津300134；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134）

植物油脂肪酸甲酯化方法比较与含量测定

伍新龄1，2，王凤玲1，2，*，关文强1，2

（1.天津市食品生物技术重点实验室，天津300134；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134）

通过比较不同甲酯化方法、气相色谱升温程序，确定了植物油中脂肪酸成分的气相色谱分析方法，并对5种食用植物油的主要脂肪酸含量进行了分析和比较。结果表明：三氟化硼-甲醇快速甲酯化法具有操作简单、时间短、甲酯化率高的优点。利用CP-Sill88高极性气相色谱柱，优化的升温程序为：初始温度170℃，保持1m in，以10℃/min升温速率升至200℃，再以1℃/m in升温速率升至220℃，保持3m in，20min内即可有效分离6种脂肪酸。用建立的方法测定5种食用植物油6种脂肪酸的含量，标准曲线的相关性好，相关系数范围为0.999 4～0.999 9，检出限低。

食用植物油；脂肪酸；甲酯化；气相色谱

食用植物油的营养价值在很大程度上取决于油脂中脂肪酸的组成和配比[1-4]。棕榈酸（C16：0）、硬脂酸（C18：0）、花生酸（C20：0）、油酸（C18：1）、亚油酸（C18：2）、亚麻酸（C18：3）6种脂肪酸含量总和占总脂肪酸95%以上[5-7]。利用气相色谱法的FID检测器对食用植物油中脂肪酸进行定性、定量分析，具有非常高的灵敏度，是脂肪酸含量测定最常用的分析手段[8-12]。但由于脂肪酸极性较强且高温下易发生聚合、脱羧、裂解等副反应，不能直接进行气相色谱分析，须先将其衍生为易挥发的甲酯[13-14]，因此，甲酯化方法选择直接影响其真实含量的测定。目前研究气相色谱法分析食用植物油中脂肪酸时采用的甲酯化方法主要有5%硫酸-甲醇溶液法、氢氧化钾-甲醇溶液法、酸碱结合法[15-20]，但这些方法存在甲酯化效果差、用时长等缺点。

本研究比较了5%硫酸-甲醇溶液法、氢氧化钾-甲醇溶液法、酸碱结合法及本课题组优化建立的三氟化硼-甲醇快速甲酯化法等4种方法的甲酯化效果，优化出最佳的食用植物油中脂肪酸的甲酯化方法；进一步利用气相色谱分析方法对5种食用植物油的脂肪酸组成进行分析和比较，为油脂的营养评价和膳食的合理搭配提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生油、玉米油、大豆油、橄榄油、调和油均购于超市。

硬脂酸甲酯标准品、油酸甲酯标准品、亚油酸甲酯标准品、花生酸甲酯标准品、亚麻酸甲酯标准品 美国NU-CHEK公司；棕榈酸甲酯标准品 中国食品药品检定研究院；正庚烷和甲醇均为色谱纯，14%三氟化硼-甲醇溶液、氯化钠、硫酸、氢氧化钾、无水硫酸钠试剂均为优级纯。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱仪（FID检测器）美国安捷伦科技有限公司；CPA225D型电子天平 德国赛多利斯公司；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；AS10200A超声波振荡器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.3 不同脂肪酸甲酯混合标样的气相色谱分析方法

将不同脂肪酸甲酯标样溶于正庚烷中制成不同浓度的适合气相色谱分析的混合标样。气相色谱柱：CP-Sil88（100m×0.25mm×0.2μm）强极性毛细管柱；进样口温度：250℃；FID检测器温度：260℃；进样量：1.0μL；分流比：30∶1；载气：高纯氮气。流速为1.0mL/min。升温程序的优化与确定：在150、170、220℃的初始柱温，1、5、10℃/min的初始升温速率，1、3℃/min的二次升温速率条件下，以分离度为指标，确定适宜的升温程序。

1.4 样品甲酯化处理方法

称取50.00mg（精确到0.01mg）植物油于25mL的容量瓶中，按下述甲酯化方法（1.4.1至1.4.4）进行甲酯化后，加入适量的饱和氯化钠溶液和4.0mL正庚烷，振摇，静置10min。取上层正庚烷液，加少许的无水硫酸钠脱水，过0.45μm有机滤膜后用于气相色谱分析。

1.4.1 5%硫酸-甲醇溶液法

油样中加入2.0mL 5%硫酸-甲醇溶液，70℃水浴60min。

1.4.2 氢氧化钾-甲醇溶液法

油样中加入1.0mL 1mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，40℃水浴30min。

1.4.3 酸碱结合法

油样中加入1.0mL 1mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，40℃水浴45min，水浴蒸干，加入2.0mL 5%硫酸-甲醇溶液，70℃水浴60min。

1.4.4 三氟化硼-甲醇快速甲酯化方法

油样中加入0.5 mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液1.5 mL，超声10min，40℃水浴10min，待溶液呈透明状后置水浴上沸腾5min，冷却后加入5.0mL三氟化硼-甲醇溶液，水浴沸腾2min。

1.5 数据分析

植物油甲酯化后，气相色谱法分析得到脂肪酸甲酯色谱图，利用标准物质相对保留时间定性，峰面积标准曲线法定量。

2 结果与分析

2.1 脂肪酸最佳测定条件

2.1.1 气相色谱程序升温适宜条件

通过比较6个不同升温程序下混合标准品及调和油（经1.4.4中方法甲酯化）中脂肪酸甲酯的分离度、响应值与峰形、保留时间，确定最佳色谱柱升温程序为：170℃保留1min，10℃/min升温至200℃，1℃/min升温至220℃保留3min。在此条件下，6种脂肪酸甲酯混合标准品溶液和调和油样品溶液的气相色谱分析结果分别见图1、图2。

2.1.2 不同脂肪酸甲酯标样的标准曲线及相关系数、检出限

采用不同浓度范围的脂肪酸甲酯标样配成的混标进行气相色谱分析，得到的标准曲线及其相关系数、检出限见表1。

由表1可以看出6种脂肪酸的线性相关方程的相关系数都在0.999以上，相关性较好，检出限低，检测灵敏度高，说明建立的脂肪酸测定方法可行。

2.2 甲酯化方法的选择

按1.4中的4种方法对调和油进行甲酯化处理，并利用优化后的气相色谱条件分析其脂肪酸含量，结果见表2。

对于同一种植物油，酯化方法不同，测出其脂肪酸含量有较大差异，脂肪酸含量越高说明甲酯化效果越好。从表2可以看出，酯化效果最好的是三氟化硼-甲醇快速甲酯化法，其次分别为酸碱结合法、氢氧化钾-甲醇溶液法和5%硫酸-甲醇溶液法。

酸法测出6种脂肪酸的含量均较低，是由于硫酸作催化剂发生甲醇脱水生成甲醚的副反应，导致甲酯化不完全，反应温度高且耗时长，不适宜测定植物油中脂肪酸的含量；碱法发生酯交换反应，条件比较温和，反应时间短，但是在碱性条件下反应同时存在产物的水解，影响甲酯化效果；根据酯化反应机理，酸碱结合形成的RO-的亲核能力远远大于ROH，促使反应加速进行，又有酸性催化剂，使油脂的甲酯化既快又完全。但当H2SO4作酸性催化剂时，脂肪酸与甲醇发生酯化反应，体系中水的存在抑制了反应进一步发生；三氟化硼-甲醇快速甲酯化法中，先用碱中和了非中性的游离脂肪酸，同样也存在RO-的亲核反应，而且BF3作酸性催化剂，能够消耗体系中存在的水形成硼酸，进一步促进反应的进行，实现结合态、游离态脂肪酸样品有效甲酯化，不破坏不饱和脂肪酸，反应时间短，且反应温度适中，脂肪酸甲酯化完全[18-20]。

三氟化硼-甲醇快速甲酯化法利用超声波技术的空化作用和机械传质作用促进了醇油的相互混合，在40℃下，加速了甲醇和油脂之间的醇解反应[21]，使脂肪酸盐直接转化成脂肪酸甲酯减少酸化步骤，防止常规法皂化时所引起的异构化。花生油、大豆油、玉米油、橄榄油和调和油的酸值均在0.5以下[22-24]，符合醇解反应最适条件。该法适用于大多数植物油脂甲酯化，用时短且测出的脂肪酸含量较高。

2.3 植物油脂肪酸含量测定

利用三氟化硼-甲醇快速甲酯化法对5种植物油进行甲酯化，按1.4的色谱条件对脂肪酸进行分析，所得的脂肪酸含量见表3。

由表3可以看出，棕榈酸、硬脂酸在5种植物油中含量差别不大，油酸在橄榄油中占绝对优势，亚油酸在玉米、大豆等油脂中的含量高，花生酸和亚麻酸在调和油中含量较高，质量分数分别为1.2%和1.0%，而在其他油中两种脂肪酸均低于1.0%。

2.4 回收率实验

调和油中分别添加3个不同浓度脂肪酸标准溶液，按1.4.4步骤对样品进行甲酯化，按采用优化的气相色谱条件进行测定，棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、亚麻酸的平均回收率分别为88.75%、89.21%、89.31%、87.95%、88.40%、89.15%。

3 结论

本研究通过对5种植物油的甲酯化分析，得出了优化后的三氟化硼-甲醇快速甲酯化法在气相色谱法的酯化效果最好，测出的脂肪酸含量最高。选用适宜的升温程序，6种脂肪酸的分离度R>1.5，定性准确，可以较准确地测定脂肪酸的百分含量。为植物油的定性定量提供依据，对于食用植物油检测有较好的参考价值。

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Methods of Methyl Esterification and Gas Chromatography Analysis of Fatty Acids in EdibleVegetable Oil

WU Xin-ling1，2，WANG Feng-ling1，2，*，GUANWen-qiang1，2
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，Tianjin 300134，China；2.College of Biotechology and Food Sciences，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

Different methods of methyl esterification and heating program of gas chromatography （GC） werecompared， and optimal parameters for GC analysis of fatty acid in vegetable oil was determined. The content ofessential fatty acids in 5 kinds of vegetable oil was also analyzed and compared. The results showed that borontrifluoride-methanol esterification was the optimal method for fatty acid analysis， which had advantages such aseasy operation， accurate results with a high methyl esterification efficiency. A highly polar capillary column（100 m×0.25 mm i.d.×0.2 mm film thickness） of CP-Sil88 （Varian， USA） was used to separate the fatty acidmethyl esters， the optimized heating program was as follows： 1） 170 ℃ for 1 min； 2） increase to 200 ℃ at arate of 10 ℃/min； 3） increase to 220 ℃ at a rate of 10 ℃/min； 4）220 ℃ for 3 min， and 6 kinds of fatty acidscan be effectively separated within 20 min. Determination of five kinds of edible vegetable oil 6 kinds of fattyacids by the established method showed a good linear ranges which correlation coefficient was from 0.999 4 to0.999 9 and a low limit of detection.

edible vegetable oil； fatty acid； methyl esterification； gas chromatograph

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.022

2014-08-04

伍新龄（1989—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品加工和保鲜新技术。

*通信作者：王凤玲（1965—），女（汉），硕士，研究方向：食品质量与安全。