山慈菇多糖对荷H22肝癌小鼠的抗肿瘤机制研究

徐小娟，蔡懿鑫，毛宇，徐芳，刘湘新，贺建华，*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南省医药技工学校，湖南长沙410000；3.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128；4.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

山慈菇多糖对荷H22肝癌小鼠的抗肿瘤机制研究

徐小娟1，2，蔡懿鑫3，毛宇1，徐芳1，刘湘新4，贺建华3，*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.湖南省医药技工学校，湖南长沙410000；3.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128；4.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128）

研究山慈菇多糖对H22肝癌实体瘤小鼠的抗肿瘤作用及其机制。制作小鼠H22实体瘤肝癌模型，通过脾脏指数、胸腺指数分析其对小鼠免疫器官的影响，Elisa检测血清白介素-2（IL-2）含量、肿瘤坏死因子（TNFα）含量，免疫组化法观察（Bcl-2）表达水平。山慈菇多糖的低、中、高剂量组抑瘤率分别为43.74%、37.57%、30.76%，；能增强血清中IL2、TNFα活性；抗凋亡因子Bcl-2的表达量不同程度地减少。山慈菇多糖对H22肝癌小鼠具有一定的肿瘤抑制作用，本次实验不体现剂量依赖性，显示山慈菇多糖无毒副作用，能增强机体的抗肿瘤能力，降低肿瘤的持续增殖能力。

抗肿瘤；山慈菇多糖；肝癌H22；IL-2；TNFα；bcl-2

山慈菇（pseudobulbus cremastrae seu pleiones）始见于《本草拾遗》[1]，为中国药典收载的少常用中药[2]。山慈菇来源复杂，名称众多[3]，本试验的山慈菇为兰科植物独蒜兰（P.yunnanensis Rolfe）的假鳞茎，习称“冰球子”假鳞茎入药，称“山慈菇”或“毛慈菇”，药材又称毛慈菇，其味甘、微辛、寒、归肝、脾经，具有清热解毒、消痈散结的功效，中医临床上常用于治疗淋巴结核，乳腺癌、食管癌、胃癌等恶性肿瘤，以及蛇、虫、狂犬咬伤[4]，降压[5]。原发性肝癌（hepato celluar carcinoma，HCC，简称肝癌），是世界上最常见的恶性肿瘤之一[6]，目前治疗肝癌仍以手术及化疗为主，但化疗易引起的肝肾毒性等不良反应[7]。多糖是一类由单糖聚合而成的多聚糖。目前，已经发现多种植物多糖具有抗肿瘤、免疫调节等作用。本实验选用小鼠肝癌H22细胞是最常用的小鼠可移植性肿瘤细胞系之一，广泛应用于小鼠肿瘤动物模型的复制。山慈菇多糖抗肿瘤的机制少见报道，因此对山慈菇多糖诱导鼠源性H22肝癌细胞凋亡的抗肿瘤机制作一初步研究。

1 材料

1.1 药物与试剂

山慈菇多糖：购自陕西西安一生物制剂公司，经鉴定为正品；腹水型肝癌H22细胞株：从北京药植所引进；IL-2、TNFα试剂盒：武汉博士德试剂公司；BCL-2：北京中杉生物试剂公司。

1.2 动物

SPF级昆明小鼠，雌性，体质量（22±2）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

2 方法

2.1 H22细胞的培育

将细胞浓度调整至1×106，注射至体重22 g～24 g昆明小鼠腹腔，在第8天将小鼠颈椎脱臼处死，抽取乳白色腹水，将细胞加0.9%生理盐水按1∶3（体积比）稀释，调整细胞浓度至1∶106，制成细胞悬液。

2.2 多糖溶液的配置

多糖按各组剂量，放置10mL离心管中用0.9%生理盐水配置，灌胃后放冰箱4℃冷藏。

2.3 动物模型建立

将细胞悬液接种到小鼠右腋，接种后出现米粒大的鼓包视为接种成功。

2.4 分组及剂量

空白组10只小鼠不接种，每组10只。山慈菇多糖高剂量组——900mg/kg溶液0.2mL，山慈菇多糖中剂量组——600mg/kg溶液0.2mL，山慈菇多糖低剂量组——300mg/kg溶液0.2m L，模型组——生理盐水0.2mL，阳性组——腹腔注射环磷酰胺20mg/kg溶液0.2mL，正常组——生理盐水0.2mL。

2.5 给药

肿瘤移植的当天记为0 d。注射48 h后，连续用药13 d。隔日称重并观察小鼠生存状态，模型组在第5天可见实体瘤体积比接种时体积有所增大，并用游标卡尺测量腋下肿瘤的长和宽。

2.6 检测指标

小鼠末次给药24 h后，给小鼠称体重、拍照、眼眶采血，3 000 r/min离心10min制备血清，Elisa试剂盒检测血清中IL-2、TNFα的活性，用75%乙醇浸泡10 s后剥取小鼠瘤组织、肝脏、脾脏、胸腺称重，瘤组织和肝脏拍照并称重，将瘤组织浸入4%多聚甲醛固定液中密封，石蜡包埋，连续切片，免疫组化用SABC三步法检测肿瘤组织中Bcl-2表达。

2.7 统计学处理

3 结果及分析

3.1 对实体瘤小鼠抑瘤率、重要免疫器官和IL-2、TNFα水平的影响

对实体瘤小鼠抑瘤率、重要免疫器官和IL-2、TNFα水平的影响，见表1。

由表1可知，山慈菇多糖低、中、高剂量组对小鼠肝癌H22实体瘤的抑制率分别为43.74%、37.57%、30.76%。经SPSS18.0单因素分析，与模型组比较，低剂量组具有极显著差异（P＜0.01），中剂量组具有显著性差异（P＜0.05），环磷酰胺组抑制率达到80.89%，与模型组比较具有极显著差异（P＜0.01），且与山慈菇多糖各剂量组相比，抑制肿瘤作用较强，山慈菇多糖低、中剂量组的TNFα、IL2活性提高，与模型组相比具有极显著性（P＜0.01）。

3.2 免疫组织化学技术观察bcl-2蛋白表达

免疫组织化学技术观察bcl-2蛋白表达，见图1。

免疫组织化学（免疫细胞化学）技术是一项利用抗原抗体反应，使标记抗体的显色剂显色来对抗原进行定位、定性、定量分析的实验技术。用免疫组织化学技术SABC三步法检测Bcl-2的蛋白表达，Bcl-2蛋白主要分布在癌细胞浆。

检测结果显示多糖组Bcl-2表达随剂量增多有所减少，模型组Bcl-2表达较高，细胞内呈强阳性反应。

4 结论

1）本试验结果显示，山慈菇多糖可以改善H22肝癌小鼠生存状态。

2）环磷酰胺和山慈菇多糖可不同程度地抑制H22荷瘤小鼠实体瘤的生长，相对模型组，山慈菇多糖中、高剂量组的效果较为明显，达到了43.74%和37.57%，山慈菇多糖组荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数下降不明显，无体质量减轻，表明山慈菇多糖对小鼠机体的毒副作用小。

3）IL-2、TNFα的变化是反映细胞功能的一个重要指标，研究发现，原发性肝癌患者外周血IL-2、TNFα水平明显低于正常人[8]。山慈菇多糖可以提高小鼠IL-2、TNFα的活性，低、中剂量组较为明显，有利于荷瘤机体的治疗，实验中还发现，多糖各剂量组荷瘤小鼠生理状态较好，食量、水量、活动量较模型、对照组强，初步揭示了其抑瘤机理之一，可能是诱导荷瘤鼠脾细胞分泌TNFα和IL-2等细胞因子[9]，从而抑制移植性肝癌H22瘤体的生长。

4）本试验检测结果显示多糖组Bcl-2表达随药物浓度增高有所减少，模型组Bcl-2表达较高，细胞内呈强阳性反应。可使Bcl-2的减少进肿瘤细胞的凋亡。山慈菇多糖的抑制肿瘤作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤的持续增殖能力有关。

综上所述，山慈菇多糖具有一定的抗肿瘤作用，其作用机制可能与免疫调节及相关蛋白表达存在一定的关联。

[1]董海玲.山慈菇的化学成分和药理作用研究进展[J].中草药, 2007,38(11).1734-1738

[2]刘新桥.中药山慈菇的化学成分及抗肿瘤活性研究[D].天津:天津大学,2007

[3] 阮小丽.山慈菇的抗肿瘤及抑菌作用[J].中药材,2009,32:1886-1888

[4]Xiao PG.Modern Chinese Materia Medica(新编中药志)[M].Beijing:Chemical Industry Press,2000

[5] Fujisawa Pharmaceutical Co,Ltd.Antihypertensive cremastosineⅠ and Ⅱ isolation:JP:57035518[P].1982-02-26

[6]高姗.原发性肝癌全人群生存率的分析和比较[J].肿瘤,2010,30 (12):1027-1032

[7]许文翠.榄香烯对荷H22小鼠的抑瘤作用和对bcl-2家族促细胞凋亡蛋白N表达的影响[D].大连:大连医科大学,2011

[8]孙振平.原发性肝癌患者外周血IL-2、Sil、2R-TNF_水平及NK细胞活性检测[D].天津:天津医科大学硕士论文,2006

[9]沈明花,李巍,金梅花.小黄蘑多糖对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究[J].中草药,2013,44(17):2433-2436

Study on Anti-tumor Effect of Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones Polysaccharide on Mice withH22 Hepatocellular Carcinoma

XU Xiao-juan1，2，CAI Yi-xin3，MAO Yu1，XU Fang1，LIU Xiang-xin4，HE Jian-hua3，*
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha410128，Hunan，China；2.Hunan Medical and Pharmaceutical Technical College，Changsha 410128，Hunan，China；3.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；4.Veterinary Faculty，Hunan Agricultuial University，Changsha410128，Hunan，China）

To study on the anti -tumor effect and mechanism of pseudobulbus cremastrae seu pleionespolysaccharide on mice with H22 hepatocellular carcinoma. The solid tumor of H22 were established to observethe anti-tumor effect of pseudobulbus cremastrae seu pleiones polysaccharide. The thymus index and spleenindex were used to analyze the influence. The serum interleukin-2 （IL-2） and tumor necrosis factor-alpha（TNF-α） levels were detected by ELISA.SABC Immunohistochemical method to observe the Bcl-2 expressionlevel. The solid tumor inhibition ratio of low， middle and high dose of pseudobulbus cremastrae seu pleionespolysaccharide treated groups were 43.74 %，37.57 %，30.76 %，respectively， Increases in serum IL2，TNFαactivity， could control the expression of Bcl -2. pseudobulbus cremastrae seu pleiones polysaccharide couldinhibit the H22 solid tumor on mice with not a dose- dependent and no obvious side effect. The probable route ofinhibitory effect of it on mice with H22 solid tumor is immune-enhancement and acceleration of cell apoptosis.

anti-tumor； pseudobulbus cremastrae seu pleiones polysaccharide； mice with H22 hepatocellularcarcinoma； Bcl-2

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.006

2014-12-02

中日政府间国际合作项目（2011DFA30490-2）

徐小娟（1987—），女（汉），在读硕士，研究方向：营养与健康。

*通信作者：贺建华，男，教授，博士，研究方向：营养与健康。