纯品7S和11S蛋白结构与表面疏水性的相关性研究

李丹，刘春雷，江连洲

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.宁德师范学院，福建宁德352100）

纯品7S和11S蛋白结构与表面疏水性的相关性研究

李丹1，2，刘春雷2，江连洲1，*

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.宁德师范学院，福建宁德352100）

以6个具有代表性的大豆品种作为实验材料提取7S和11S，经Superdex 200凝胶柱层析纯化制得纯品7S和11S，用凯氏定氮和SDS-PAGE电泳综合分析其纯度在90%以上。采用SDS-PAGE电泳测定纯品7S和11S的亚基组分，用圆二色光谱分析纯品7S和11S的二级结构，用ANS荧光探针法测定纯品7S和11S的表面疏水性。经分析得出如下结论：大豆蛋白质的表面疏水性与α/亚基含量不相关，与α亚基含量呈正相关，与β亚基含量呈负相关；与酸性亚基含量呈负相关，与碱性亚基含量呈正相关；与α-螺旋含量呈负相关，与β-折叠含量呈负相关，与β-转角含量呈正相关，与无规则卷曲含量呈正相关。

纯品7S和11S；Superdex200凝胶柱层析；亚基；圆二色光谱；表面疏水性

疏水作用是一种配位体间非共价键相互作用，对蛋白质的稳定性、构象和蛋白质的功能性具有重大意义[1-2]。一般来说，构成蛋白质的非极性氨基酸侧链主要分布于分子内部形成疏水内核，而极性氨基酸主要分布在蛋白质分子表面的亲水环境中。但对于已知结构的蛋白质表面性质的研究表明，部分疏水基团会出现在蛋白质表面，使蛋白质表面也具有一定的疏水性，即表面疏水性。由于表面疏水性影响蛋白质分子间的相互作用，因此相比于整体的疏水性，表面疏水性对蛋白质的功能具有更大的影响[3]。众多研究表明，蛋白质的表面疏水性显著影响蛋白质的溶解性、乳化性、凝胶性等其他功能特性[4-7]，可见蛋白质表面疏水性是衡量蛋白质功能性质的关键指标之一。研究大豆蛋白亚基组分和二级结构与表面疏水性构效关系的重要意义在于为今后开发SPI特定功能性产品而进行分子设计和重组提供重要的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：大豆，东农42（东北农业大学大豆研究所提供）；黑农46、合丰55（黑龙江省农业科学院大豆所提供）；冀豆12（河北省农林科学院粮油作物研究所提供）；皖豆28（安徽省农业科学院作物研究所提供）；福豆234（福建省农业科学院作物研究所提供）。大豆粉碎后过40目筛，用正己烷脱脂，得脱脂大豆粉。

试剂：ANS（1-苯胺基-8-萘磺酸）和电泳用试剂均为Sigma公司，KH2PO4、K2HPO4、NaCl和β-巯基乙醇为优级纯，其余试剂为分析纯。

主要仪器：AKTA Explorer蛋白质纯化仪（美国GE公司），Mini-Protean 4电泳仪（美国Bio-Rad公司），Tanon凝胶成像系统（上海天能公司），F-4500荧光分光光度计（日本HITACHI公司），J-815圆二色光谱仪（日本Jasco公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 纯品7S和11S的制备

参照Nagano法稍加修改[8-11]。脱脂豆粉→0.03mol/L Tris-HCl缓冲液（料液比1∶15）、pH8.5、45℃水浴中搅拌1 h→离心（4℃，9 600×g，30min）→上清液→加固体SBS至0.01mol/L，调pH6.4，4℃过夜→离心（4℃，6 500×g，20min）→沉淀→溶于KP缓冲液（2.6mmol/L KH2PO4，32.5 mmol/L K2HPO4，0.4 mol/LNaCl，10mmol/L β-巯基乙醇，离子强度0.5，pH7.6）→离心（4℃，9 600× g，30min）→上清液→凝胶柱层析纯化（Superdex 200凝胶柱，流速1mL/min，洗脱液为pH7.6的KP缓冲液）→收集液→透析→冻干→11S纯品。

4℃过夜冷沉离心上清液→调pH4.8→离心（4℃，6 500×g，20min）→沉淀→复溶于4℃、pH8.5的0.03mol/L Tris-HCl缓冲液→调pH6.2→离心（4℃，9 600×g，30 min）→上清液→调pH7.6→51%的饱和硫酸铵盐析→离心（4℃，9 600×g，30min）→上清液→100%的饱和硫酸铵盐析→离心（4℃，6 500×g，20min）→沉淀溶于KP缓冲液（同上）→凝胶柱层析纯化（条件同11S）→收集液→透析→冻干→7S纯品。

1.2.2 SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE采用不连续垂直板状凝胶电泳[12-13]。凝胶厚度1mm，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。电泳凝胶分析采用Tanon凝胶成像系统软件分析。

1.2.3 表面疏水性的测定

采用ANS荧光探针法[14-16]。分别称取0.25 g蛋白样品溶于50m L磷酸盐缓冲液（2.6 mmol/L KH2PO4，32.5mmol/L K2HPO4，pH7.6），室温下搅拌1 h，20℃、10 000 r/min离心30min，上清液用同一磷酸盐缓冲液依次稀释（采用Lowry法测定蛋白浓度在0.07mg/m L～0.67mg/mL之间）。分别取不同浓度的稀释样品4mL，加入40μL浓度为8mmol/L的ANS溶液（采用上述磷酸盐缓冲液配制），迅速混匀后静置3 min，在390 nm的激发波长和470 nm的发射波长下测定荧光强度，狭缝5 nm，同时测定未加ANS的相应浓度的样品溶液的荧光强度做空白。以蛋白质浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，曲线初始阶段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数S0。

1.2.4 圆二色光谱分析

采用远紫外区域圆二色光谱研究纯品7S和11S大豆蛋白的二级结构[17-18]，圆二色谱（CD）扫描波长范围为250 nm～200 nm，常温下（25±1）℃，扫描速度为100 nm/min，样品池光程为0.1 nm，灵敏度为100mdeg/ cm。样品浓度为0.4mg/m L，用pH7.6的KP缓冲液配制。用平均摩尔椭圆率[θ]来表示CD数据，单位为deg· cm2·dmol-1。通过CDPRO软件分析CD色谱图数据，使用的算法为CONTIN/LL，使用的参考蛋白为SMP56（Optimized for190-240 nm#Lessnm required），取蛋白平均残基浓度MRW为115 g/moL，计算波长范围为200 nm～240 nm，计算α-螺旋，β-折叠，β-转角与无规则卷曲的含量[19]。每个样品重复3次测定。

1.2.5 统计与分析

单项实验重复3次，结果表示为均值±标准差。采用SPSSV18.0软件对数据进行单因素方差分析和相关性分析，如果方差分析差异性显著（P＜0.05），则使用Duncan进行多重比较。采用Origin8.0软件、CDPro软件包等进行图谱分析处理和图表制作。

2 结果与讨论

2.1 纯品7S和纯品11S的制备

纯品7S和纯品11S的蛋白质含量，即凯氏定氮结果见表1。

可见纯品7S和纯品11S的非蛋白杂质极少，蛋白质含量接近100%。采用SDS-PAGE还原电泳方法鉴定纯品7S和纯品11S的纯度，即纯品7S中7S蛋白百分含量和纯品11S中11S蛋白百分含量，鉴定结果见表2。

纯品7S和纯品11S的最终纯度见表3。

可见自制实验用纯品7S和纯品11S的纯度较高，均在90%以上，纯品11S的纯度高于纯品7S，在95%以上。

2.2 纯品7S和纯品11S的表面疏水性分析

如图1所示，纯品11S的表面疏水性存在极显著的差异（P＜0.01），表面疏水性值S0在1 432.73～1 623.00之间。东农42、黑农46和合丰55的纯品11S的表面疏水性值高出其它品种的幅度较大。如图2所示，纯品7S的表面疏水性存在极显著的差异（P＜0.01），表面疏水性值S0在707.14～868.54之间。合丰55、黑农46和福豆234的纯品7S的表面疏水性值高出其它品种的幅度较大。表面疏水性在品种间呈现的差异性可能是由于不同大豆品种的11S蛋白和7S蛋白具有不同的氨基酸组成、亚基组成和空间构象等导致的。为了探究亚基组分和二级结构对表面疏水性的影响程度（即与表面疏水性之间的构效关系），我们做了此项研究。

2.3 亚基组分对表面疏水性的影响

本研究采用的是SDS-PAGE还原电泳，旨在反映各样品的亚基组成情况，并探讨亚基组分与表面疏水性的构效关系。如图3和图4所示。

自上向下的第一条分子量约为82 KDa的谱带是7S的α′亚基，第二条分子量约为67 KDa的谱带是7S的α亚基，第三条分子量约为50 KDa的谱带是7S的β亚基。图3中第四条分子量约为41KDa的A3亚基、第五条分子量约为32-37KDa的A1A2A4亚基和最后的A5亚基均为11S的酸性亚基A；第六条分子量约为20 KDa的谱带是11S的碱性亚基B。经Tanon凝胶成像系统分析得出纯品7S和纯品11S各亚基含量，详见表4和表5。

由表4可知，纯品11S均不含有α′亚基；除东农42-11S和黑农46-11S含有极少量的α亚基外，其余4个品种的纯品11S均不含α亚基；纯品11S均残存不同程度的β亚基（P＜0.01），可见β亚基是纯品11S的主要杂质。纯品11S的酸性亚基含量均大于其碱性亚基含量，其含量接近于碱性亚基含量的2倍。相关性分析表明：纯品11S的酸性亚基A的含量与表面疏水性呈负相关（r=-0.719，P=0.001），碱性亚基B的含量与表面疏水性呈正相关（r=0.522，P=0.026）。

由表5可知，纯品7S均残存不同程度的酸性亚基A（P＜0.01），均不含有碱性亚基B，可见酸性亚基A是纯品7S的杂质。东农42-7S的α亚基含量极少，仅为其它品种纯品7S的七分之一左右，而α′亚基含量和β亚基含量很高，α′亚基含量约为其它品种纯品7S的1.5倍，β亚基含量其它品种纯品7S的2倍。此外，除东农42-7S外，其它品种的纯品7S均以α亚基含量最高。相关性分析表明：纯品7S的α′亚基含量与表面疏水性不相关（r=-0.230，P=0.358），α亚基含量与表面疏水性呈正相关（r=472，P=0.048），β亚基含量与表面疏水性呈负相关（r=-0.603，P=0.008）。

2.4 二级结构对表面疏水性的影响

研究二级结构与表面疏水性的关系要基于溶液条件，因此采用圆二色光谱（CD）测定样品的二级结构。远紫外圆二色光谱（250 nm～200 nm）是肽键的吸收峰范围，反映了主链构象，是一种测量蛋白质二级结构的灵敏技术，它能直接用来解释蛋白质的二级结构四种类型的含量。纯品7S和纯品11S的远紫外CD图谱如图5和图6所示。

图谱中208 nm和222 nm处有两个负凹槽，对应α-螺旋的负科顿效应，但222 nm处负槽不是特别明显，说明纯品7S和纯品11S含有α-螺旋结构，但α-螺旋含量不多。图谱中217 nm处呈现一个负峰，是典型的β-折叠结构，220 nm～230 nm之间有一个微弱的正峰，说明纯品7S和纯品11S存在无规卷曲结构[20]。应用CONTIN/LL程序拟合纯品7S和纯品11S的二级结构四种类型的含量并进行方差分析，详见表6和表7。

由表6和表7可知，纯品7S和纯品11S的二级结构以β-折叠含量最高，其次是无规则卷曲，α-螺旋含量最少。东农42-11S的α-螺旋含量显著低于其它品种，无规则卷曲含量显著高于其它品种。合丰55-11S的β-折叠含量显著低于其它品种。福豆234-11S的α-螺旋含量显著高于其它品种，无规则卷曲显著低于其它品种。东农42-7S的α-螺旋含量和β-折叠含量显著高于其它品种，β-转角含量和无规则卷曲含量显著低于其它品种。合丰55-7S的β-折叠含量显著低于其它品种，β-转角含量显著高于其它品种。福豆234-7S的α-螺旋含量显著低于其它品种，无规则卷曲显著高于其它品种。

相关性分析表明：纯品11S的α-螺旋含量与表面疏水性呈负相关（r=-0.841，P=0.036），β-折叠含量与表面疏水性呈负相关（r=-0.847，P=0.033），β-转角含量与表面疏水性呈正相关（r=0.871，P=0.024），无规则卷曲含量与表面疏水性呈正相关（r=0.853，P=0.031）。纯品7S的α-螺旋含量与表面疏水性呈负相关（r=-0.894，P=0.016），β-折叠含量与表面疏水性呈负相关（r= -0.819，P=0.046），β-转角含量与表面疏水性呈正相关（r=0.889，P=0.018），无规则卷曲含量与表面疏水性呈正相关（r=0.891，P=0.017）。

3 结论

大豆蛋白质的亚基组分与表面疏水性存在一定的相关性：大豆蛋白质的表面疏水性与α′亚基含量不相关（r=-0.230，P=0.358），与α亚基含量呈正相关（r= 472，P=0.048），与β亚基含量呈负相关（r=-0.603，P= 0.008）；与酸性亚基含量呈负相关（r=-0.719，P= 0.001），与碱性亚基含量呈正相关（r=0.522，P=0.026）。

大豆蛋白质的二级结构四种类型的相对含量与表面疏水性相关性显著：大豆蛋白质的表面疏水性与α-螺旋含量呈负相关（r=-0.841～-0.894，P＜0.05），与β-折叠含量呈负相关（r=-0.819～-0.847，P＜0.05），与β-转角含量呈正相关（r=0.871～0.889，P＜0.05），与无规则卷曲含量呈正相关（r=0.853～0.891，P＜0.05）。

表面疏水性显著影响大豆蛋白质的功能特性，明确大豆蛋白质的亚基组分及二级结构与表面疏水性的相关性，对今后开发SPI特定功能性产品而进行分子设计和重组有重要意义。

[1]蒋将.pH偏移处理诱导熔球态大豆蛋白的结构变化及功能性质的改善[D].无锡:江南大学,2011:26

[2]涂宗财,汪菁琴,李金林,等.大豆蛋白动态超高压微射流均质中机械力化学效应[J].高等学校化学学报,2007,128(11):2225-2228

[3]Sheard PR,Fellows A,Ledward DA,et al.Macromolecular charges associated with the heat treatment of soya isolate[J].Food Technology,1988,21(12):55-60

[4] Luo DH,Zhao Q Z,Zhao M M,et al.Effects of limited proteolysis and high-pressure homogenization on structural and functional characteristics of glycinin[J].Food Chemistry,2010,122(1):25-30[5]华欲飞,CuiSW,WangQ,等.不同大豆分离蛋白凝胶的流变学性质[J].中国粮油学报,2003,18(6):43-48

[6]Semisotnov G V,Rodionaca N A,Razgulyzev O I,et al.Study of the“molten globule”intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe[J].Biopolymers,1991,31(1):119-128

[7]陈复生,李里特,辰巳英三.分子力对大豆蛋白透明凝胶作用机理研究[J].食品科学,2001,22(10):27-32

[8] Nagano T,Hirotsuka M,Mori H.Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin from soybeans[J].J Agric and Food Chem, 1992,40(6):941-944

[9]Chun Liu,HonglingWang,Zhumei Cui,et al.Optimization of extraction and isolation for 11Sand 7S globulins of soybean seed storage protein[J].Food Chemistry,2007,102(4):1310-1316

[10]孙鹏,秦贵信.蒸汽处理对纯化大豆抗原含量及免疫原性的影响[J].中国兽医学报,2006,26(5):551-554

[11]潘思轶.大豆蛋白的分子修饰及特性研究[D].武汉:华中农业大学,2005:73

[12]Liu G,Xiong Y L.Electrophoretic pattern,thermal denaturation,and in vitro digestibility of oxidized myosin[J].J Agric and Food Chem, 2000,48(3):624-630

[13]王显生,麻浩,向世鹏,等.不同SDS-PAGE分离胶浓度下大豆贮藏蛋白亚基的分辨效果[J].中国油料作物学报,2004,26(2): 75-80

[14]Shimada K,Cheftel J C.Determination of sulfhydryl groups and disulfide bonds in heat-induced gels of soy protein isolate[J].Agriculture and Food Chemistry,1988,36(1):147-153

[15]Kato A,Nakai S.Hydrophobicity determined by a fluorescence probe method and its correlation with surface properties of proteins [J].Biochimica Biophysica Acta,1980,624(1):13-20

[16]王中江,江连洲,魏冬旭,等.pH值对大豆分离蛋白构象及表面疏水性的影响[J].食品科学,2012,33(11):47-51

[17]Greenfield H J.Methods to estimate the conformation of proteins and polypeptides from circular dichroism data[J].Anal Biochem,1996, 235(1):1-10

[18]张涛,江波,王璋.鹰嘴豆分离蛋白质的特性[J].食品与生物技术学报,2005,24(3):66-71

[19]Sreerama N,Woody RW.Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra:comparison of CONTIN,SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set[J].Anal. Biochem,2000,287(2):252-260

[20]邓克权.脱脂豆粕残余脂质对大豆蛋白分级分离及其结构与功能的影响[D].无锡:江南大学,2013:48

The Pu rity of 7 s and 11 s which Studied by the Protein Structure and Surface Hydrophobicity

LI Dan1，2，LIU Chun-lei2，JIANG Lian-zhou1，*
（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University Harbin 150030，Heilongjiang，China；2.Ningde Normal University，Ningde 352100，Fujian，China）

The7sand 11s were extracted from six representative soybean varieties which were as experimental material.The purity of 7sand 11s which purified by the Superdex 200 gel column chromatography system were more than 90%by SDS-PAGE electrophoresis and Kjeldahl.Determined by SDS-PAGE electrophoresis pure 7Sand 11S subunit component，secondary structure by circular dichroism spectroscopy of pure 7Sand 11S，the surface hydrophobicity of 7s and 11s was determined by the ANS fluorescence probe Method.The conclusion showed that the surface hydrophobicity of Soybean protein was not associated with the content of the subunit α；was positively correlated with the content of the subunit α；was negative correlation with the content of the subunit β；was negative correlation with the content of the Acidic subunit；was positively correlated with the content of the Basic subunit；was negative correlation with the content of the α-helix；was negative correlation with the content of the β-fold；was positively correlated with the content of the β-corner；was negative correlation with the content of the random coil.

purity 7S and 11S；superdex 200 gel column chromatography；subunit；circular dichroism；surface hydrophobicity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.002

2015-01-20

国家自然科学基金项目“大豆球蛋白亚基组分空间构象与表面疏水性构效关系研究”（C200101）；福建省教育厅A类科技项目（JA12344）

李丹（1983—），女（满），在读博士，研究方向“粮食、油脂及植物蛋白工程。

*通信作者：江连洲，教授，博士生导师，主要从事粮食、油脂及植物蛋白工程方面的研究。