应用microCT对大鼠不对称力脊柱侧凸模型椎体终板微结构的观察*

张恒岩崔立强王储吴志宏姚杰邱贵兴**

（1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院骨科及转化医学中心，北京100730；2.北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京100191）

应用microCT对大鼠不对称力脊柱侧凸模型椎体终板微结构的观察*

张恒岩1崔立强1王储1吴志宏1姚杰2邱贵兴1**

（1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院骨科及转化医学中心，北京100730；2.北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京100191）

背景：椎体终板由椎体的骨骺骨化形成，脊柱侧凸畸形导致椎体终板承受不正常的应力，此病理情况下椎体终板结构的改变尚未完全明确。

目的：使用microCT对大鼠不对称力脊柱侧凸模型椎体终板结构的变化进行观察。

方法：选取5周龄雌性SD大鼠15只，手术将钛钉由大鼠L2、L5右侧横突根部置入椎体，并连结镍钛弹簧建立腰椎不对称力脊柱侧凸模型。7周后使用microCT对脊柱侧凸顶点处椎体终板进行扫描分析，Mimics软件对椎体终板骨性结构及内部孔道结构进行3D重建。

结果：7周后大鼠脊柱腰段侧凸Cobb角由术后即刻平均25.7°±2.4°进展至平均61.5°±5.4°，microCT平扫重建数据显示脊柱侧凸的凹侧椎体终板较凸侧明显变薄，其内部孔道结构稀疏，骨体积分数（BV/TV）明显增加。

结论：腰椎不对称力导致脊柱侧凸的凹侧椎体终板趋向形成一致密的薄骨板，这种病理改变可能对凹侧椎体的生长及椎间盘的营养产生不利影响。

脊柱；脊柱侧凸；模型，动物；大鼠

Background:The vertebral endplate is formed by epiphyseal ossification of the vertebral body.Abnormal mechanical loading appears inscoliosisascompared to normal spines.Howthe vertebral endplatewaschangedinscoliosisisnotwellunderstood. Objective:To determine structural changes of vertebral endplate in asymmetric load scoliosis rat models by microCT.

Methods:Fifteen 5-week-old female Sprague-Dawley rats were selected to develop lumbar scoliosis by using a nickel-titanium(NT)coil spring.Two bone screws were implanted in vertebral bodies via the roots of right transverse processes of L2 and L5.The two ends of NT coil spring attached to L2 and L5 screws.MicroCT was used to analyze the vertebral endplate at the curve apex in rat lumbar scoliosis models after 7 weeks and the 3D models of the endplate bone structure and the internal canal structure were reconstructed by Mimics software.

Results:The average initial coronal Cobb angle was 25.7°±2.4°immediately after the operation and increased to 61.5°±5.4° on average over 7 weeks.The 3D models showed that the concave side of the scoliotic endplate was thinner than the convex side,the structure of canals was sparse,and the bone volume fraction significantly increased.

Concl usions:The concave side of the vertebral endplate tends to form a thin dense bony plate under lumbar asymmetric load. Suchpathologicalchangesmayadverselyaffectthegrowthofconcavesideofthevertebraeandtheintervertebraldiscnutrition.

特发性脊柱侧凸的发病原因目前尚未明确，但其进展因素已得到较深入的研究，根据Hueter-Volkmann定律：骨骺所受压力增加，骨生长受到抑制；骨骺所受压力降低，骨生长加速。大量实验也证实不对称力是造成脊柱侧凸进展的重要因素[1-4]。脊柱侧凸患者的凹侧椎体及椎间盘承受较大的应力[5,6]，造成凹侧椎体生长迟缓。椎体终板是椎体上下面的骨骺骨化停止后形成的骨板，由椎体的次级骨化中心发育而成，在生长发育阶段对椎体的生长起着重要的作用。观察不对称力作用下终板结构的变化有助于进一步揭示脊柱侧凸的凹侧椎体生长迟缓的机制。此外，椎间盘在人体出生后第4年即丧失血液供应[7]，椎体终板成为椎间盘营养物质的主要来源[8,9]，组织学观察发现椎体终板内存在孔道结构，其内容物主要为骨髓样组织及血管床[10]，此孔道结构对椎间盘的营养起重要作用，其结构改变会对椎间盘的营养产生影响[11]。可见椎体终板在椎体的生长及椎间盘营养代谢方面起重要作用，研究椎体终板在不对称力脊柱侧凸中的改变对于揭示脊柱侧凸椎体及椎间盘的异常有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验选取5周龄雌性SD大鼠15只（北京协和医院实验动物中心提供），平均体重（129±4.6）g（122～137 g）。5周龄大鼠处于幼年期，此阶段大鼠的体重、生长潜力、手术的耐受能力为建立脊柱侧凸模型的适宜鼠龄[12,13]。实验动物采取标准化饲养，自由饮水，环境温度23℃，湿度56%，12 h昼夜照明节律。

本实验选取弹力范围0～100 g，初始长度8.0 mm的超轻弹力镍钛（NT）弹簧（韩国Dentos公司提供）15枚 ；长 度6.0 mm，直 径1.2 mm的 钛 合 金 骨 钉（selfdrilling，韩国Dentos公司提供）30枚。NT弹簧具有镍钛合金超弹性（superelastic）的特点，其弹性特征不再遵循胡克定律，在一定形变范围内弹力变化较小，可以保持相对“恒定”的弹力（图1）。

1.2 建立大鼠不对称力脊柱侧凸模型

图1 四种不同应力的NT弹簧应力-应变曲线图（摘自韩国Dentos公司产品数据资料）

本实验前期已成功建立大鼠不对称力脊柱侧凸模型[14]（图2、3），所有大鼠均采用腹腔注射2%的戊巴比妥钠（40 mg/kg）全身麻醉，麻醉成功后取俯卧位，术区备皮及消毒。以大鼠髂骨为解剖标志，定位腰椎各节段，行L1～L6后正中线右侧长约2.5 cm纵形切口，切开皮肤、皮下组织，剥离棘旁肌，暴露L2及L5节段右侧横突根部，使用1 ml注射器针头（直径0.5 mm；长度16 mm；美国BD公司提供）自L2及L5节段右侧横突根部斜行锥入椎体，行术中X线检查以确保定位准确，拔除定位针头，以相同位置及角度置入钛合金骨钉，将选取的NT弹簧以0号非可吸收缝合线（Somerville，美国强生公司提供）固定在L2及L5钉头部位，此时弹簧将在L2至L5右侧产生拉力（图4）。生理盐水冲洗手术切口并逐层缝合，术后3 d予腹腔注射青霉素（10万U/kg）预防感染。手术用时约60 min，术后约90 min清醒，12 h后恢复正常饮食，5 d后拆除缝线。术后即刻及术后1、3、5、7周（术后7周时即实验大鼠12周龄，已达体成熟）行正、侧位X线片检查并测量Cobb角及弹簧长度（图2），术后7周使用microCT（Skyscan 1076，比利时Micro Photonics公司提供）对大鼠脊柱侧凸部位进行扫描后测量脊柱侧凸顶点部位椎体的旋转度（图3）。

图2 不同时间点大鼠脊柱正、侧位X线片及侧凸Cobb角

图3 术后7周测得大鼠顶椎旋转度为22.5°

图4 术中置钉完成后将NT弹簧与钛钉连结

图5 终板及邻近椎体骨质3D重建模式图

图6 终板内孔道结构的3D模式图

1.3 MicroCT扫描及3D 重建

术后7周，以致死量戊巴比妥钠腹腔注射并处死大鼠，剥离腰椎L2～L5节段，剥离过程注意保护腰椎骨质结构，生理盐水保持组织湿润，并使用显微器械尽量去除周围肌肉及附着的软组织，以减少microCT扫描时周围结构对腰椎成像的干扰。

使用microCT对取得标本进行扫描，设定扫描参数：电压70 kV，电流141 μA，像素大小9.485 μm，旋转扫描范围180.0°。

扫描完成后将扫描原始图像导入microCT系统自带的NRecon重建软件中，经图形工作站运行计算后得到大鼠L2～L5横断面图像，本实验研究选取位于脊柱侧凸顶点部位的L3椎体下终板重建图像进行研究。

将选取的L3椎体下终板横断面图像导入Mimics软件中，参考椎体皮质骨及骨小梁灰度值，选取骨质的适宜灰度范围，对椎体终板及邻近椎体骨质进行重建得到3D图像（图5）。

选取不同扫描层面的骨性椎体终板区域为兴趣区域（region of interest,ROI），选择性删 除 区域内的骨质部分，留下椎体终板内的孔道部分，将其进行3D模型重建，得到椎体终板内孔道的三维模式图（图6）。

1.4 计算椎体终板骨体积分数及厚度

骨体积分数（bone volume fraction,bone volume/ total vol以椎体终板纵轴将重建得到的L3椎体下终板3D模型分为凸侧及凹侧两部分，应用CTAn软件microCT配套软件）对凸侧及凹侧L3椎体下终板进行BV/TV计算。

由于髓核对应的椎体终板区域向凸侧发生迁移，且此部位椎体终板结构仅为一菲薄骨质结构，故本研究仅选取外周终板区域（椎间盘纤维环对应区域：内侧边界为髓核终板与纤维环终板交界处，外侧边界为骨性终板的边缘）进行厚度的测量。应用Mimics软件，选取经椎体终板纵轴中点的冠状位图像，选定凸侧椎体终板测量区域（图7），并将其长度定为100%，测量25%、50%、75%部位椎体终板的厚度，并取其平均值代表凸侧区域椎体终板厚度。选取冠状位图像上与凸侧椎体终板测量区域相对应的凹侧椎体终板进行厚度测量，同法测得凹侧区域椎体终板厚度。

图7 经终板纵轴中点的冠状位图像

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。对脊柱侧凸的凸侧及凹侧L3椎体下终板的BV/TV及终板厚度采用配对t检验进行统计学分析，显著性水平α=0.05。

表1 大鼠不对称力脊柱侧凸模型术后不同时间Cobb角及弹簧拉力变化情况（）

表1 大鼠不对称力脊柱侧凸模型术后不同时间Cobb角及弹簧拉力变化情况（）

?

表2 大鼠脊柱侧凸的凸侧及凹侧终板的BV/TV及厚度（）

表2 大鼠脊柱侧凸的凸侧及凹侧终板的BV/TV及厚度（）

?

2 结果

2.1 大鼠不对称力脊柱侧凸模型Cobb 角及弹簧拉力

大鼠脊柱腰段侧凸冠状面Cobb角由术后即刻平均25.7°±2.4°进展至术后7周平均61.5°±5.4°；矢状面Cobb角由术后即刻平均8.8±1.4°进展至术后7周平均18.8°±2.1°（图2）；弹簧拉力由术后即刻平均（57.6± 3.1）g下降至术后1周平均（50.7±2.2）g，至术后7周弹簧拉力上升至（69.9±2.9）g（详细数据见表1）。

2.2 终板3D 结构

应用Mimics软件对椎体终板骨质进行重建获得3D图像（图5）可看到脊柱侧凸的凹侧椎体终板结构较凸侧明显宽大，且髓核对应的终板区域向凸侧发生迁移。将椎体终板内的管道结构进行重建，得到3D模型（图6），可见脊柱侧凸的凸侧椎体终板内的管道结构较发达，凹侧椎体终板内管道结构稀疏，与髓核相对应的椎体终板部位由于骨质结构极其菲薄，并未重建出管道样结构。

2.3 终板骨体积分数及厚度

大鼠脊柱侧凸的凸侧及凹侧L3椎体下终板的BV/TV数据均符合正态分布（表2）。凸侧L3椎体下终板BV/TV指数平均为74.5%±2.4%，凹侧为81.1%± 3.0%，相比较有统计学差异（P＜0.05）。在经终板纵轴中点的冠状位图像上，凸侧区域L3椎体下终板的平均厚度为（0.48±0.04）mm，凹侧为（0.31±0.08）mm，相比较有统计学差异（P＜0.05）。

3 讨论

特发性脊柱侧凸的发病原因尚未明确，但既往的研究已证实不对称力是脊柱侧凸进展的重要因素。与目前各类脊柱侧凸栓系模型相比较，本实验应用镍钛弹簧建立大鼠侧凸模型，使不对称力得以量化，实验结果显示大鼠体成熟前，弹簧的拉力/大鼠体重范围可保持在44.5%～27.8%，与站立位时腰椎所承受的重力接近，且本实验模型侧凸Cobb角进展速度快，术后3周（大鼠8周龄，逐步进入性成熟阶段）已进展至平均61.4°，克服了目前各类脊柱侧凸不对称栓系模型仅能依靠生长潜力使侧凸角度逐渐进展的缺点[15-19]，是目前研究脊柱侧凸较适宜的模型之一。

本研究应用microCT对终板骨性结构及其内部孔道进行三维重建后显示，在不对称力作用下，终板结构发生了改变，与髓核区域对应的终板结构向凸侧发生了迁移，在特发性脊柱侧凸患者椎间盘的相关研究中也发现了类似的改变[5]。既往研究显示，终板是椎间盘获取营养物质的主要来源，其内部的孔道结构含有血管床[10]，此类骨性孔道的减少常伴有椎间盘退变的发生[11]，推测其对椎间盘营养物质的获取有重要的作用。本实验结果显示脊柱凹侧终板内的孔道结构较凸侧明显稀疏（图6），其BV/TV指数明显高于凸侧，此种结构改变可能对椎间盘营养物质的获取产生负面影响，既往的研究也显示AIS患者纤维环中Ⅰ型、Ⅱ型胶原的含量在凹侧明显低于凸侧，凹侧椎间盘存在着基质合成代谢的异常，不能产生足够量的正常Ⅰ、Ⅱ型胶原来维持椎间盘的生物力学功能[20]。脊柱侧凸的凹侧椎间盘物质代谢障碍加重了椎间盘楔形变的程度，从而成为侧凸角度进展的原因之一。以往实验证实终板的骨化增加，引起椎间盘营养障碍，与椎间盘的退变有一定关系。但本实验通过microCT只能建立骨性终板模型，无法对软骨终板进行研究，存在一定的局限性。

此外，实验结果还显示，在终板横轴上，凹侧区域终板的厚度较凸侧区域明显变薄，椎体终板由生长期椎体的次级骨化中心骨化形成，对椎体的纵向生长起着重要的作用，凹侧区域终板的厚度较薄，提示此部位较高的应力抑制了次级骨化中心纵向骨化速度，进而造成凹侧椎体的生长迟缓。综上所述，椎体终板结构在不对称力作用下，骨质结构发生了改变，尤其是凹侧椎体终板的改变可能对椎间盘的物质代谢及椎体的生长都产生不利的影响，椎体终板在侧凸的进展中可能起着重要的作用，其结构的改变促使侧凸角度进一步加重，而侧凸角度的进展使凹侧椎体终板承受更大的应力，从而进一步加重了终板结构的病理改变，此两种过程相互促进共同造成侧凸角度的不断加重。研究如何阻断此过程对于脊柱侧凸的治疗有着重要的意义。本实验主要是对不对称力下终板形态学方面的研究观察，并未对其功能进行研究，且目前脊柱侧凸病因尚未明确，是否先出现终板不对称性病理改变，再导致整体侧凸形成，何为因果，暂无定论。对于此类终板形态学研究的前景价值，尚不明朗。但上述研究结果提示我们，椎体终板在脊柱侧凸进展中可能起着重要的作用。对其进一步的研究可能会为脊柱侧凸的防治提供新的途径。

[1]Mente PL,Aronsson DD,Stokes IA,et al.Mechanical modulation of growth for the correction of vertebral wedge deformities.J Orthop Res,1999,17(4):518-524.

[2]Mente PL,Stokes IA,Spence H,et al.Progression of vertebral wedging in an asymmetrically loaded rat tail model. Spine(Phila Pa 1976),1997,22(12):1292-1296.

[3]Rubin CT,Lanyon LE.Regulation of bone formation by applied dynamic loads.J Bone Joint Surg Am,1984,66(3): 397-402.

[4]Stokes IA,Spence H,Aronsson DD,et al.Mechanical modulation of vertebral body growth.Implications for scoliosis progression.Spine(Phila Pa 1976),1996,21(10):1162-1167.

[5]Meir AR,Fairbank JC,Jones DA,et al.High pressures and asymmetrical stresses in the scoliotic disc in the absence of muscle loading.Scoliosis,2007,2:4.

[6]Wilke HJ,Neef P,Caimi M,et al.New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine(Phila Pa 1976),1999,24(8):755-762.

[7]Kobayashi S,Baba H,Takeno K,et al.Fine structure of cartilage canal and vascular buds in the rabbit vertebral endplate.Laboratory investigation.J Neurosurg Spine,2008,9 (1):96-103.

[8]Holm S,Maroudas A,Urban JP,et al.Nutrition of the intervertebral disc:solute transport and metabolism.Connect Tissue Res,1981,8(2):101-119.

[9]Ogata K,Whiteside LA.1980 Volvo award winner in basic science.Nutritional pathways of the intervertebral disc.An experimental study using hydrogen washout technique. Spine(Phila Pa 1976),1981,6(3):211-216.

[10]Gruber HE,Ashraf N,Kilburn J,et al.Vertebral endplate architecture and vascularization:application of micro-computerized tomography,a vascular tracer,and immunocytochemistry in analyses of disc degeneration in the aging sand rat. Spine(Phila Pa 1976),2005,30(23):2593-2600.

[11]RutgesJP,JagtvanderOP,OnerFC,etal.Micro-CTquantification of subchondral endplate changes in intervertebral disc degeneration.OsteoarthritisCartilage,2011,19(1):89-95.

[12]Messer NA,I'Anson H.The nature of the metabolic signal that triggers onset of puberty in female rats.Physiology& behavior,2000,68(3):377-382.

[13]Engelbregt MJ,van Weissenbruch MM,Popp-Snijders C,et al.Body mass index,body composition,and leptin at onset of puberty in male and female rats after intrauterine growth retardation and after early postnatal food restriction.Pediatric research,2001,50(4):474-478.

[14]Zhang H,Wang C,Wang W,et al.Novel experimental scoliosis model in immature rat using nickel-titanium coil spring.Spine(Phila Pa 1976),2013,38(19):E1179-1188.

[15]Odent T,Cachon T,Peultier B,et al.Porcine model of early onset scoliosis based on animal growth created with posterior mini-invasive spinal offset tethering:a preliminary report.Eur Spine J,2011,20(11):1869-1876.

[16]Liu L,Zhu Y,Han X,et al.The creation of scoliosis by scapula-to-contralateral ilium tethering procedure in bipedal rats:a kyphoscoliosis model.Spine(Phila Pa 1976), 2011,36(17):1340-1349.

[17]Schwab F,Patel A,Lafage V,et al.A porcine model for progressive thoracic scoliosis.Spine(Phila Pa 1976),2009,34 (11):E397-404.

[18]Braun JT,Ogilvie JW,Akyuz E,et al.Creation of an experimental idiopathic-type scoliosis in an immature goat model using a flexible posterior asymmetric tether.Spine(Phila Pa 1976),2006,31(13):1410-1414.

[19]Braun JT,Ogilvie JW,Akyuz E,et al.Experimental scoliosis in an immature goat model:a method that creates idiopathic-type deformity with minimal violation of the spinal elements along the curve.Spine(Phila Pa 1976),2003,28 (19):2198-2203.

[20]朱锋,邱勇,郑伟娟,等.青少年特发性脊柱侧凸患者椎间盘纤维环胶原的分布及其意义.中国脊柱脊髓杂志, 2004,14(4):4.

Observation of vertebral endplates microstructure in a scoliosis rat model with asymmetric load by using microCT*

ZHANG Hengyan1,CUI Liqiang1,WANG Chu1,WU Zhihong1,YAO Jie2,QIU Guixing1**
(1.Department of Orthopedics and Transformation Center of Medical Science,Peking Union Medical College Hospital,PUMC& CAMS,Beijing 100730;2 School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University,Beijing 100191,China)

Spine;Scoliosis;Models,Animal;Rats

国家自然科学基金资助项目（81000817）

**通信作者：邱贵兴，E-mail：qiuguixingpumch@gmail.com