小檗碱抗结直肠癌机制研究

赵雨佳，龚 丹，程亚龄

小檗碱又称黄连素，是从黄连属植物根茎中提取的一种异喹啉类季铵生物碱，在我国传统医学中有悠久的使用历史，其主要药理作用包括抗心律失常、降低胆固醇、改善胰岛素抵抗、抑菌、抗炎和抗抑郁等［1，2］。近年来诸多研究均发现，小檗碱具有良好的抗肿瘤作用，能够有效抑制各种不同组织来源的恶性肿瘤，其作用机制涉及肿瘤细胞增殖、凋亡、迁徙、转移等各个环节，且针对不同类型的肿瘤，其作用机制也不尽相同［3，4］。结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康，目前其治疗手段是手术、化疗、放疗相结合的综合治疗［5］，对其治疗方法进行研究，仍然是目前的研究热点，开发效率高、作用明显、不良反应低的新药已成为研究的新方向。

目前已有许多研究证实，在体内、体外实验中小檗碱均能有效抑制结直肠癌，且其对正常肠黏膜细胞的损伤作用较轻。针对小檗碱抗结肠癌机制的研究主要集中在抑制肿瘤细胞的形成、诱导凋亡、抑制增殖、影响扩散等方面［6］。

1 抑制肿瘤细胞的形成

氧化损伤能够诱导正常细胞向肿瘤细胞转化，抗氧化作用是小檗碱抑制肿瘤形成的靶点之一。Thirupurasundari等［7］通过氧化偶氮甲烷（AOM）15 mg／kg皮下注射形成Wistar大鼠结肠癌模型，分别在造模过程中及造模后给予30 mg／kg小檗碱灌胃处理。结果发现AOM诱导组发生了脂质过氧化损伤和抗氧化防御系统的改变，小檗碱与AOM共同和先后作用均能活化和增强细胞内多种还原酶SOD、过氧化氢酶、GST、GSH及维生素C、E的活性，消除AOM诱导产生的氧化物LPO、ROS，同时小檗碱干预后血清中糖蛋白的下降水平也具有统计学意义。此外，电镜下细胞超微结构显示小檗碱作用后，肠上皮细胞出现核固缩、核染色质边集、线粒体肿胀和内膜嵴减少等凋亡特征性变化。证明小檗碱通过抗氧化作用抑制正常细胞向肿瘤细胞的转化，从而发挥抑制肿瘤形成的作用。

吴 柯 等［8］以 二 甲 肼 （1，2－dimethylhydrazine，DMH）40 mg／kg皮下注射＋1%葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）水溶液饮用诱导形成大鼠结肠癌模型，观察小檗碱和美洛昔康灌服后，连续16周后大鼠体重、异常隐窝灶（abrrant crypt foci，ACF）和结肠癌发生率的变化。结果发现与模型组相比，小檗碱明显改善DMH＋DSS诱癌过程中大鼠恶病质状态并遏制体重减轻，显著减少实验第10周结肠ACF数、明显降低结肠癌的发生率，其作用与美洛昔康组相似。

2 诱导肿瘤细胞凋亡

2．1 小檗碱通过线粒体途径诱导凋亡 小檗碱主要通过影响ROS相关的信号通路JNK／p38 MAPK、PKC、ERK等来激活线粒体途径，通过内源性线粒体凋亡通路发挥诱导凋亡的作用［9，10］。Wang 等［11］将小檗碱50 μmol分别作用于结肠癌IMCE细胞1、3、6、18、24 h 和12．5、25、50、100 μmol小檗碱分别作用IMCE细胞18 h后，结果发现作用时间18、24 h、小檗碱浓度50、100 μmol能显著诱导细胞死亡；同时测定凋亡标志物LDH的水平，其释放量与小檗碱呈浓度和时间依赖性。他们测定了与外源性凋亡通路相关的 caspase－3、－6、－9、－12，发现均未被活化，同时caspase抑制剂zVAD－fmk无法缓解小檗碱的抑制作用；又通过Annexin X／PI染色法确定小檗碱作用后 Annexin X（＋）／PI（＋）细胞的数量明显增加，因此他们认为小檗碱通过线粒体途径发挥作用。Wang等进一步研究发现小檗碱作用于IMCE细胞后浓度依赖性地增加了ROS的量，ROS诱导了溶酶体中组织蛋白酶B（cathepsin B）的释放，引起了线粒体膜的去极化，存在于线粒体内膜间隙的可溶性蛋白——凋亡诱导因子 （apoptosis inducing factor，AIF）通过外膜被释放出来，最终引起细胞的程序性死亡。

Hsu 等［12］将小檗碱不同剂量组 5、10、25、50μmol，不同作用时间 3、6、12、24 h作用于 SW620细胞，MTT实验测定细胞增殖活性结果发现小檗碱浓度越高、作用时间越长，抑制生长作用越明显；超微形态学观察、DAPI染色、Annexin－V染色等均证明小檗碱诱导了细胞凋亡。又通过对氧化物敏感的DHE染色法检测ROS的水平、Western blotting法检测细胞色素C、PARP裂解物的量及MAPK通路的p38／MAPK、JNK、ERK的磷酸化水平，发现明ROS和MAPK通路有关，ROS能够时间依赖性地磷酸化JNK和p38，活化相应的MAPK通路，从而磷酸化激活了转录因子C－Jun，最终导致细胞色素C的释放。

Murthy等［13］发现小檗碱可直接引起线粒体膜的破坏从而导致凋亡。他们用rhodamine－123染色法测定线粒体膜电位，发现50 μmol小檗碱作用24、48、72 h 后线粒体膜电位分别下降 30%、27．5%、25%，膜通透性增加，细胞色素C从线粒体中释放，形成了由细胞色素C、连接蛋白Apaf1和caspase－9酶原组成的凋亡复合体，启动Caspase激活事件的级联反应，引起底物发生蛋白水解反应，细胞最终死亡。Li等［14］和 Jantova 等［15］也都观察到小檗碱诱导ROS的产生，引起细胞内Ca2＋浓度的升高和线粒体膜电位的下降进而去极化，细胞色素C释放激活凋亡通路。

2．2 小檗碱影响凋亡相关分子的表达 在肿瘤细胞凋亡过程中，小檗碱能够影响caspase、抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白、Fas和FasL等的表达。Yan等［16］用流式细胞术检测 10、25 μg／ml小檗碱作用于BIU－27和T24细胞48 h后的凋亡比例，BIU－27和T24 细胞在对照组、10 μg／ml作用组、25 μg／ml作用 组 分 别 为 0．04% 、7．7% 、19．61% 和 0．06% 、11．41%、54．40%，均具有统计学意义； 同时用Western blotting法测定 caspase－3、－9 及其裂解物的含量变化，caspase－3、－9 的量没有明显变化，但它们的裂解物在小檗碱作用后呈浓度依赖性上升，他们认为小檗碱诱导凋亡与caspase－3、－9活化有关。Ho等［17］的研究也得出相似的结论，小檗碱能够明显提高 caspase－3、－8、－9 的活性，提高凋亡水平。Patil等［18］测定小檗碱作用后肿瘤细胞中DNA的碎片量和凋亡标志物PARP裂解物的变化，结果显示25 μmol小檗碱作用72 h后DNA碎片和PARP裂解物的量明显增加，证明细胞凋亡增加；作用48、72 h后，抗凋亡蛋白Bcl－2的水平与未干预组比明显减少。Lu等［19］运用RT－PCR测定小檗碱作用组Fas、FasL mRNA的表达水平，发现分别为对照组的4．69、1．31 倍 ，Fas、FasL 分 别 为 对 照 组 的 214．02、28．84 倍，同时 TNF－α mRNA、TNF－α、TRAF－1 较小檗碱干预前均有明显增高。

2．3 小檗碱调控凋亡相关转录因子的表达 NAG－1和ATF3是与细胞凋亡相关的转录因子，他们编码的蛋白质参与细胞凋亡、并且能够抑制肿瘤细胞的形成，研究表明其在正常细胞中的表达水平明显高于肿瘤细胞［20］，且能够被多种抗炎、抗癌药物激活［21］。Piyanuch 等［22］测定了 50μmol小檗碱作用 24 h后不同结肠癌细胞中NAG－1和ATF3的表达水平，其中CaCo－2中 NAG－1表达增加，SW480中 ATF3表达增加，HCT－116中 NAG－1和 ATF3表达均增加，证明小檗碱的诱导效应具有细胞特异性；进一步研究证明小檗碱通过对p53的活化诱导ATF3的表达，通过对 ERK1／2、PKC、GSK－3β 蛋白激酶通路的作用诱导NAG－1的表达。

2．4 小檗碱具有遗传毒性 Liu等［23］发现小檗碱通过p53活化途径发挥DNA的损伤作用，通过免疫荧光染色和免疫印迹法测定γ－H2AX的含量以及微核试验，发现γ－H2AX和微核的量随小檗碱量的升高而升高。此外还有研究表明小檗碱在一定的pH条件下，能够直接与肿瘤细胞DNA结合形成DNA－小檗碱复合物［24］，且与 polyA的结合能力强于polyU、polyC；导致DNA双螺旋解聚，活化p53和 ATM（ataxia telangiectasia mutated），最终诱导细胞凋亡［25］。还能与mRNA结合，抑制移位和转录，同时可以部分嵌入tRNA，干扰氨基酸的转运［26］。

2．5 小檗碱影响细胞膜离子通道的开放 陈明锴等［27］将 0．1、0．3、3．0、30．0 μmol／L 小檗碱作用于HT－29 细胞 24、48、72、96 h 后，MTT 检测细胞增殖、流失细胞术检测凋亡率发现抑癌率和凋亡率较对照组明显增高；膜片钳检测延迟整流钾通道IK（V）发现 0．1、0．3、3．0、30．0 μmol／L 小檗碱能浓度依赖性抑制 HT－29细胞 IK（V），阶跃刺激为＋80 mV 时，对照组、0．3、3．0、30．0 μmol／L 小檗碱组 IK（V）分别为（488±42）、（372±22）、（296±25）、（225±34） pA，0．3、3．0、30．0 μmol／L 小檗碱组 IK（V）分别为对照组的（77．16±5．41）%、（61．35±6．09）%、（45．87±7．62）%，他们认为小檗碱通过抑制结肠癌细胞IK（V）的开放抑制增殖并诱导凋亡。刘善文等［28］使用高渗和低渗灌流液以及氯通道阻断剂研究小檗碱激活的SW480全细胞氯电流的生理学和药理学特性，小檗碱（10 nmol／L）可诱发 SW480细胞迅速产生氯电流，该电流没有明显的时间依赖性失活和电压依赖性失活，细胞外灌流高渗液可几乎完全抑制小檗碱激活的氯电流，而低渗液外灌流可激活一个氯电流，其特性与小檗碱激活的氯电流相似，氯通道阻断剂NPPB、tamoxifen能显著抑制小檗碱激活的氯电流。以上实验结果提示，小檗碱可以激活细胞膜上的氯通道，且氯通道对氯通道阻断剂和细胞容积变化敏感，进而通过改变离子通道的活动来影响细胞周期、增殖以及细胞凋亡。

3 抑制肿瘤细胞增殖

目前研究已发现小檗碱主要通过对周期蛋白（cyclin）、周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）、周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子（CKI）的调控阻断细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖。He 等［29］观察到 10、40、80 μmol小檗碱作用于QBC939细胞后，MTT法测定在24、48 h两个时间点的吸光度值均显著小于对照组，同时80 μmol小檗碱作用于正常肠上皮细胞HIBEC 48 h后未观察到明显的细胞毒作用，证明小檗碱在抑制肿瘤细胞增殖的同时对正常细胞的毒作用较小。流式细胞术测定结果发现G1期细胞明显增加、S期细胞明显下降，细胞周期被阻断在G1－S阶段；进一步western blotting法测定G1期到S期的周期相关蛋白发现，小檗碱发挥上调作用是通过上调CKI p21、p15，同时减少Cdk2和Cdk4的活化。Liu等［30］也观察到小檗碱抑制肿瘤细胞的生长，且呈浓度和时间依赖性；流式细胞术测定G1期细胞比例上升的同时S期细胞下降，又将BrdU作为标记物证实进入S期的细胞减少，从而认为细胞周期停滞在G1－S阶段。同时发现G1－S期停滞与p53基因的作用有关，小檗碱能够浓度依赖性地引起p53蛋白水平的上升；p53突变细胞株中，G1、S期细胞数量及比例较对照组没有明显变化，阻滞细胞周期的作用减弱，他们得出结论小檗碱通过p53依赖的途径调节cyclin E、cyclin D1，阻滞细胞增殖的正常进行。

Cai等［31］通过 WST－1 实验和克隆形成实验观察到小檗碱能够抑制四株结直肠癌细胞的生长，将40 μmol小檗碱作用于LoVo细胞24 h后，进行细胞周期分析发现G2－M期的比例由10．5%上升到32．5%，细胞增殖停滞在 G2－M 阶段，同时 cyclinB1、cdc2、cdc25c的量较对照组明显升高，证明小檗碱通过调控细胞周期相关蛋白抑制增殖，但其具体机制仍不清楚。

小檗碱还通过抑制COX－2的转录抑制细胞增殖。吴柯等［32］通过MTT实验观察loVo细胞的增殖情况、RT－PCR法检测COX－2的表达水平、Western blotting法检测COX－2蛋白的表达水平，结果发现小檗碱在浓度＞10－5mol／L时可以显著抑制 lovo细胞增殖，诱导凋亡，且呈浓度和时间依赖性，并能浓度依赖性地降低COX－2 mRNA和COX－2蛋白的表达，证明小檗碱通过抑制COX－2表达发挥抑制细胞增殖、诱导凋亡的作用。王邦茂等［33］也发现小檗碱可抑制DCA诱导的HT－29人结肠癌细胞增殖，抑制COX－2 mRNA和蛋白表达及PGE2合成，认为这一作用可能是小檗碱抑制HT－29细胞增殖的机制之一。Fukuda等［34］认为小檗碱作用于COX－2基因的启动子，抑制COX－2基因的转录，从而降低PGE2的水平，浓度依赖性的抑制结肠癌DLD－1细胞的生长。

外源性促生长因子能够调节细胞增殖过程，小檗碱通过干扰外源性促生长途径抑制细胞增殖。Wang 等［35］观察到未进行干预时 IMCE 和 HT－29 细胞中上皮生长因子受体 （epidemal growth factor receptor，EGFR）和其磷酸化水平明显升高，肿瘤细胞中存在EGFR的过度表达和活化。小檗碱作用后不仅能显著下调基础表达的EGFR及其磷酸化物的量，还有效抑制了上皮生长因子（epidemal growth factor，EGF）诱导的EGFR的活化，同时实时定量PCR测定EGFR mRNA水平没有明显变化，证明小檗碱不是从基因表达水平调控EGFR含量的；又检测到泛素连接酶Cb1磷酸化水平升高，免疫沉淀法测定磷酸化Cb1和EGFR的交联物及EGFR的泛素化物含量升高。根据实验结果，他们认为小檗碱能够提高Cb1的磷酸化水平，从而增强其对EGFR的泛素化水平，最终导致EGFR的在细胞膜上的重组或降解破坏，外源促生长因子无法作用于结肠癌细胞，抑制细胞增殖。

4 抑制肿瘤细胞的扩散

研究已证实小檗碱通过作用于细胞内重要的信号通路从而抑制多种肿瘤细胞的侵袭，包括IKK、NF－κВ、ERK、AMP 等介导的信号通路。Ho等［36］通 过 划 痕 实 验 、Transwell 实 验 观 察 到 62．5 μmol、125 μmol小檗碱作用24、48 h后迁移、侵袭能力明显 被 抑 制 ，MMP－2、MMP－9、u－PA、FAK、p－JNK、NF－κB的水平与对照组相比明显下降，结合其他同类实验结果，他们认为小檗碱通过FAK、p－JNK、NF－κB信号通路抑制在肿瘤转移中发挥重要作用的 MMP－2、MMP－9、u－PA 的表达。Park 等［37］发现小檗碱作用于多株结肠癌细胞后诱导产生ROS，激活腺 苷 酸 活 化 蛋 白 激 酶 （AMP－activated protein kinase，AMPK）通路，通过AMPK依赖性途径抑制整合素β1的翻译，整合素β1蛋白水平下降，其下游分子Src、FAK、p130Cas磷酸化下降；小檗碱也能够直接影响整合素β1的稳定性，导致蛋白降解，从而抑制其介导的肿瘤细胞黏附、迁徙、侵犯能力的下降。Kim等［38］通过黏附实验、划痕实验、Transwell实验观察到小檗碱有效抑制肿瘤细胞的黏附、迁徙，也证实了ROS的产生激活了AMPK通路，并同时发现ERK活化水平和COX－2表达的下降，得出结论小檗碱通过活化AMPK通路抑制ERK信号通路和COX－2的表达，起到抑制肿瘤细胞黏附、迁徙和侵犯周围组织的作用。小檗碱在体外实验中也显示了较好的抑制肿瘤扩散的作用。Mitani等［39］用小檗碱40 mg／kg灌胃肿瘤模型小鼠14 d后，发现淋巴结转移明显减少，小檗碱与抗癌药物伊立替康共同作用后产生协同效应，较单独作用组更显著地抑制了肿瘤在原发部位的生长以及淋巴结的转移。

Murthy等［40］研究还发现小檗碱能够抑制肿瘤转移过程中血管的形成，作用72 h后能够显著下调血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）且这一作用与 caspase－8的活化相关，又进一步测定与血管形成、caspase－8相关的TNF相关凋亡诱导受体（TNF－related apoptosis－inducing ligand，TRAIL）、 凋亡诱导因子 （apoptosis inducing factor，AIF）、存活素（survivin），结果发现 TRAIL 没有明显变化，作用12 h后AIF、suivivin的水平上升，48 h后两者含量均下降。

5 抑制结肠癌细胞的其他机制

5．1 小檗碱影响鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）的表达 ODC是肿瘤标志物多胺合成代谢途径中的第一个限速酶，ODC活性的异常会引起包括肿瘤在内的一系列疾病的发生，研究发现肠黏膜细胞内高ODC活性和多胺含量是肠癌发生的主要因素［41］。王桂香等［42］的研究中荧光定量PCR 结果 显 示 25、50、100 μmol／L 盐 酸 小 檗 碱 对 ODC mRNA表达虽有下调趋势，但差异无统计学意义，Western blotting结果表明盐酸小檗碱可显著下调ODC蛋白表达，且随着药物浓度的增加，表达逐渐降低，具有剂量依赖效应，表明小檗碱对ODC的影响可能是在翻译水平上的调控。

5．2 小檗碱和化疗药物及放疗的协同作用 小檗碱与化疗药物或放疗共同作用于肿瘤细胞时，能够产生协同作用，作用效果显著强于单独作用。研究发现AS2O3与铂类药物的化疗方案中，加用小檗碱后能够明显提高对HeLa、SNU－5、胶质瘤细胞等多种肿瘤细胞的细胞毒作用［43］；Liu 等［44］将 ER 受体拮抗剂和小檗碱联合用于ER受体阳性的乳腺癌细胞MCF－7的治疗，发现能够有效抑制细胞生长。此外放射线与小檗碱对 A549［45］、HepG2［46］等肿瘤细胞在细胞凋亡上也表现出抑制的协同作用。但目前协同作用的具体机制仍不清楚。

5．3 小檗碱参与细胞自噬 研究发现小檗碱在发挥细胞毒作用诱导肿瘤细胞死亡的过程中，不仅参与细胞凋亡还加速了细胞自噬。Peng等［45］通过小檗碱作用于肺癌细胞的研究发现，细胞出现了一系列自噬的特征性形态学改变，同时参与自噬过程的Beclin－1和Bcl－2分子的调控，从而证实小檗碱参与了细胞自噬过程。Wang等［47］的研究也发现小檗碱能够提高肿瘤细胞中Beclin－1的表达，并且抑制mTOR对自噬过程的调控。由于细胞凋亡和自噬调节网络的复杂性和交叉性，小檗碱对自噬过程的具体作用机制还有待进一步研究。

综上所述，可知植物有效成分已成为抗癌新药开发的重要来源，小檗碱因其广泛药理活性有效抑制肿瘤细胞而成为研究热点。未来其抗癌机制的研究将集中在基因水平，通过进一步探讨小檗碱在细胞信号通路、细胞周期调控、凋亡诱导及抑制、肿瘤抑制物、mRNA等中的作用机制，确定抑癌精确靶点，并且确定针对不同恶性肿瘤的作用剂量，设计短期化疗方案。目前对于小檗碱抑制恶性肿瘤的研究还主要集中在实验室阶段，缺乏临床实验证据和支持，将通过作用机制的进一步阐明，并结合临床效果和反应，开发出高效低毒的新型化疗药物。

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