苦参碱对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及其机制

毛玲，汪顺才，陈超，梁靓，左念，祝寅，李伟萍(句容市人民医院，江苏句容212400)

苦参碱对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及其机制

毛玲，汪顺才，陈超，梁靓，左念，祝寅，李伟萍
(句容市人民医院，江苏句容212400)

摘要:目的探讨不同浓度苦参碱对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及其机制。方法将对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞随机均分为观察组和对照组。观察组分别加入1.0、2.0、3.0 mg/mL苦参碱(分别为低、中、高浓度)，对照组不予处理。采用MTT法检测两组细胞增殖抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡率，RT-PCR法检测程序性细胞死亡因子4( PDCD4) mRNA相对表达量。结果细胞增殖抑制率:对照组为8.19%±2.35%，观察组低、中、高浓度分别为18.02%±3.13%、30.20%±3.52%、53.32%±2.72%;观察组各浓度与对照组比较及观察组各浓度间比较，P均＜0.05。细胞凋亡率:对照组为4.06%±1.59%，观察组低、中、高浓度分别为10.75%±2.36%、19.08%±4.39%、25.63%±1.96%;观察组各浓度与对照组比较及观察组各浓度间比较，P均＜0.05。细胞PDCD4 mRNA相对表达量:对照组为0.35±0.06，观察组低、中、高浓度分别为0.52±0.06、0.67±0.04、0.82±0.07;观察组各浓度与对照组比较及观察组各浓度间比较，P均＜0.05。结论不同浓度苦参碱均可抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖、诱导其凋亡，并呈剂量依赖性;其作用机制可能与提高细胞内PDCD4 mRNA表达有关。

关键词:胃癌;细胞增殖;细胞凋亡;苦参碱;程序性细胞死亡因子4

研究表明，肿瘤发生与肿瘤细胞增殖和凋亡异常有关;程序性细胞死亡因子4( PDCD4)基因是阻止细胞肿瘤性转化的抑癌基因，在不同肿瘤细胞凋亡过程中，PDCD4基因存在不同程度的表达［1，2］。苦参碱是从中药苦参中提取的一种新型药物，主要通过调节肿瘤细胞基因表达而发挥抗肿瘤作用［3～5］。2012年8月～2014年11月，我们观察了不同浓度苦参碱对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响，并探讨其是否与PDCD4基因表达有关。

1　材料与方法

1.1材料人胃癌SGC-7901细胞购自中国科学院细胞库。苦参碱(粉末，纯度≥98%)购自中鑫科技生物有限公司，RPMI-1640培养基和FBS均购自赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司，四甲基偶氮唑蓝( MTT)和二甲基亚砜( DMSO)均购自美国Sigma公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。PDCD4 mRNA引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计及合成，β-actin由艾博思生物工程技术服务有限公司设计及合成。

1.2细胞培养人胃癌SGC-7901细胞在RPMI 1640培养基(含10% FBS及1%青霉素-链霉素)中，于37℃、5% CO2、100%湿度条件下传代培养5～6 d传代1次。

1.3苦参碱对细胞增殖抑制率影响的观察采用MTT法。取对数生长期的SGC-7901细胞，调整细胞密度为1×104/mL，接种于96孔板中，随机分为观察组、对照组。观察组分别加入1.0、2.0、3.0 mg/mL的苦参碱(分别为低、中、高浓度，每浓度设6个复孔)，对照组( 6个复孔)不予处理，作用24 h同时设置加入培养液的细胞作为空白对照。各组每孔加入MTT( 5 mg/mL) 20 μL，培养箱孵育4 h，吸去孔内培养上清液。加入DMSO 150 μL，震荡15 min 于1 h内上酶标仪检测其波长492 nm的吸光度，即OD492值。观察组细胞增殖抑制率= (空白对照OD492－观察组OD492)/空白对照OD492×100%，以同样的方法计算对照组细胞增殖抑制率。

1.4苦参碱对细胞凋亡率影响的观察采用流式细胞术。取对数生长期的SGC-7901细胞，以1 ×105/孔接种于6孔板中，随机分为观察组、对照

组。观察组分别加入低、中、高浓度的苦参碱(每浓度设3个复孔)，对照组( 3个复孔)不予处理，作用24 h。4℃预冷的PBS洗涤2次，1 000 r/min离心10 min，重悬于200 μL的Binding Buffer中。加入10 μL的Annexin V-FITC后，室温避光15 min，再加300 μL的Binding Buffer及5 μL的PI，充分混匀，于1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5苦参碱对细胞PDCD4 mRNA相对表达量影响的观察采用RT-PCR法。取对数生长期的SGC-7901细胞，调整细胞密度为1×104/mL，接种于50 mL细胞培养瓶中。观察组分别加入低、中、高浓度的苦参碱，对照组不予处理，对照组及观察组各浓度均设3个样本，作用24 h。采用TRIzol试剂提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度及完整性，以OD260/OD280在1.8～2.0为纯净RNA标准。按说明书步骤逆转录mRNA为cDNA。PDCD4上游引物: 5'-AAAGGCGACTAAGGAAAAACTCATC-3'，下游引物: 5'-GCCTATCCAGCAACCTTCCCT-3'，引物长度129 bp。β-actin上游引物: 5'-CGAAACTACCTTCAACTCCATC-3'，下游引物: 5'-AGTGATCTCCTTCTGCATCCT-3'，引物长度130 bp。扩增条件: 94℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃( PDCD4)或56℃(β-actin)退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环;最后72℃延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用电脑成像分析系统检测PCR产物与β-actin的积分光密度比值，半定量分析目的基因相对表达量。

1.6统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组细胞增殖抑制率和凋亡率比较细胞增殖抑制率:对照组为8.19%±2.35%，观察组低、中、高浓度分别为18.02%±3.13%、30.20%± 3.52%、53.32%±2.72%;观察组各浓度与对照组比较及观察组各浓度间比较，P均＜0.05。细胞凋亡率:对照组为4.06%±1.59%，观察组低、中、高浓度分别为10.75%±2.36%、19.08%±4.39%、25.63%±1.96%;观察组各浓度与对照组比较及观察组各浓度间比较，P均＜0.05。

2.2两组细胞PDCD4 mRNA表达比较对照组细胞PDCD4 mRNA相对表达量为0.35±0.06，观察组低、中、高浓度分别为0.52±0.06、0.67±0.04、0.82±0.07;观察组各浓度与对照组比较及观察组各浓度间比较，P均＜0.05。

3　讨论

苦参碱是中药苦参的主要活性成分，具有抗炎抗过敏、抗纤维化、免疫调节及抗肿瘤等多种药理活性。研究表明，苦参碱对多种肿瘤细胞(如人神经母细胞瘤细胞、白血病细胞、肺腺癌细胞等)均有明显的杀伤作用［6～11］。其抗肿瘤作用机制主要有抑制肿瘤细胞增殖，诱导其分化凋亡，抗肿瘤细胞黏附与浸润转移，逆转肿瘤细胞多重耐药，抑制肿瘤新生血管形成以及增强化疗药物敏感性等。

目前，胃癌的发病机制尚不完全清楚。PDCD4是新近发现的一种具有磷酸酶活性的抑癌基因，具有阻止细胞肿瘤性转化、抑制肿瘤细胞增殖及侵袭促进凋亡、参与细胞周期调控、提高抗肿瘤药物化疗敏感性等作用［5］。PDCD4基因定位于10q24，cDNA 长3.5 kb，其中编码区约1.4 kb。PDCD4存在于大多数正常组织细胞的细胞核中，当细胞周围环境发生改变时，可通过核输出信号转移到细胞质中。因此，PDCD4在某些细胞凋亡的诱导过程中表达上升，在某些侵袭性肿瘤中则表达下降［5］。研究发现，在多种恶性肿瘤(如胃癌、肝癌、肾母细胞瘤等)细胞中均可检测到PDCD4 mRNA及蛋白表达减少甚至缺失，并与肿瘤恶性程度及患者预后密切相关［12］;胃癌组织PDCD4蛋白表达下降甚至缺失，并与胃癌低分化有关［13］。

本研究结果显示，观察组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、PDCD4 mRNA表达均随苦参碱浓度升高而升高，且观察组各浓度上述指标均明显高于对照组。进一步证实苦参碱可抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖、诱导其凋亡，并呈剂量依赖性;其作用机制可能与提高细胞内PDCD4 mRNA表达有关。本研究结果为苦参碱治疗胃癌提供了新的理论依据。

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收稿日期:( 2015-01-29)

通信作者:汪顺才，E-mail: wangshun1978@ sina.com

基金项目:江苏大学医学临床科技发展基金资助项目( JLY20140074)。

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0023-03

文献标志码:A

中图分类号:R329.26

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.008