NPPB在大鼠肝细胞分离中的应用效果及其机制

梁珊，石詠中，聂盛丹，黄韧，徐伟，李灼日(湖南省人民医院，长沙410005)

NPPB在大鼠肝细胞分离中的应用效果及其机制

梁珊，石詠中，聂盛丹，黄韧，徐伟，李灼日
(湖南省人民医院，长沙410005)

摘要:目的观察5-硝基-2( 3-苯丙胺) -苯甲酸( NPPB)在大鼠肝细胞分离中的应用效果，并探讨其可能的机制。方法将12只SD大鼠随机分为观察组和对照组各6只。两组分离肝细胞后，采用改良的四步胶原酶分离技术进行消化，制备肝细胞悬液。观察组在使用灌注液进行消化的过程中加入NPPB。采用血细胞计数板计算肝细胞收获量，PAS染色后计算纯度，0.4%台盼蓝染色后计算成活率。细胞无血清培养24 h后，采用全自动生化分析仪检测上层清液中的白蛋白( ALB)、ALT。采用紫外线分光光度法检测LDH吸光度，并计算LDH释放率。采用RT-PCR法检测细胞线粒体氯通道蛋白4( CLIC4) mRNA表达，Western blotting法检测细胞CLIC4蛋白表达。结果观察组与对照组肝细胞收获量分别为( 4.41±0.20)×108、( 4.40±0.26)×108个，纯度分别为90%±1%、89%±2%，成活率分别为88%±2%、85%±1%;两组比较，P均＞0.05。观察组与对照组ALB分别为( 43.8± 5.0)、( 25.2±3.0) g/L，ALT分别为( 47.8±6.0)、( 104.3±11.7) U/L，LDH释放率分别为21.0%±2.7%、34.0% ±2.4%;两组比较，P均＜0.05。观察组与对照组CLIC4 mRNA相对表达量分别为1.01±0.02、1.62±0.01，CLIC4蛋白相对表达量分别为0.38±0.02、0.52±0.03;两组比较，P均＜0.05。结论肝细胞分离过程中应用NPPB可以在不影响分离细胞收获量、纯度及成活率的情况下，减轻肝细胞膜结构和功能损伤，其机制可能与抑制CLIC4表达有关。

关键词:肝细胞分离;氯通道阻断剂; 5-硝基-2( 3-苯丙胺) -苯甲酸;氧化应激;线粒体氯通道蛋白4

Application effect and mechanism of NPPB during hepatocyte isolation of rats

LIANG Shan，SHI Yong-zhong，NIE Sheng-dan，HUANG Ren，XU Wei，LI Zhuo-ri

( People's Hospital of Hunan Province，Changsha 410005，China)

Abstract:Objective To observe the application effect and mechanism of 5-nitro-2-( 3-phenylpropylamino) benzoate acid( NPPB) during the hepatocyte isolation of rats.Methods Twelve Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups，6 in each group: the observation group and the control group，and the hepatocytes of the two groups were isolated by a collagenase perfusion with a modified four-step technique.In addition，we added NPPB to the observation group in the process of using perfusion fluid for digestion.The purity was determined by PAS staining，the hepatocyte yield was detected by cell count technique and the survival rate were determined after 0.4% Trypan blue staining.Cells were cultured in serum-free medium for 24 h，and we collected the supernatant at different times after isolation.LDH release rate content was detected，and the levels of ALB and ALT were detected by automatic biochemistry analyzer.The mRNA level of mitochondrial chloride intracellular channel 4 ( CLIC4) was determined by RT-PCR.CLIC4 protein level was detected by Western blotting.Results The hepatocyte yields of the observation group and the control group were( 4.41±0.20)×108and ( 4.40±0.26)×108，respectively; the purity was 90%±1% and 89%±2%，respectively; and the survival rates were 88%±2% and 85%±1%，respectively.Significant difference was found between the two groups ( all P＜0.05).The levels of ALB in the observation group A and the control group were ( 43.8±5.0) and ( 25.2±3.0) g/L，the levels of ALT were ( 47.8±6.0) and ( 104.3±11.7) U/L，and the release rates of LDH were 21.0%±2.7% and 34.0%± 2.4%，respectively; and significant difference was found between the two groups ( all P＜0.05).The relative expression levels of CLIC4 mRNA in the observation group and the control group were 1.01±0.02 and 1.62±0.01，the protein ex-

pression levels of CLIC4 were 0.38±0.02 and 0.52±0.03，respectively; and significant difference was found between the two groups ( all P＜0.05).Conclusions During the hepatocyte isolation，the application of NPPB does not affect the yield，purity and the survival rate and alleviates the membranous structure and the injury of function，which may be related with the inhibition of protein expression of CLIC4.

Key words:hepatocyte isolation; chloride channel blocker; 5-nitro-2-( 3-phenylpropylamino) benzoate acid; oxidative stress; mitochondrial chloride intracellular channel 4

生物工程学技术的进步使肝细胞移植( HCT)有望成为临时或较长期肝支持治疗的有效方法。获得大量高活力的游离肝实质细胞是HCT成功的先决条件［1，2］，其中分离技术是最关键的一步。线粒体氯通道蛋白4( CLIC4)是一种胞内氯通道蛋白，主要分布在高尔基体、线粒体、细胞核等部位;其表达上调参与代谢/氧化应激造成的细胞损伤过程，并促进细胞凋亡［3，4］。2010年1月～2013年1月，我们在大鼠肝细胞分离过程中应用氯通道阻断剂5-硝基-2( 3-苯丙胺) -苯甲酸( NPPB)，观察其对分离肝细胞存活率及细胞膜结构、功能的影响，现分析结果并探讨其机制。

1　材料与方法

1.1材料8～10周龄的SD大鼠12只，体质量300～350 g，雌雄不限，由湖南农业大学东创实验动物中心提供。Ⅳ胶原酶、台盼蓝、TRIzol试剂盒均购于Invitrogen公司，抗CLIC4多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体均购于美国Santa Cruz公司。

1.2肝细胞分离及干预大鼠饲养于清洁环境中，自由进食水，12 h昼夜生活节律。按照随机数字表法将12只大鼠随机分为观察组和对照组，各6只。两组均参照以往的研究［5］行肝细胞分离，采用改良的四步胶原酶分离技术进行消化，观察组在使用灌注液进行消化的过程中加入100 μmol/L的NPPB。消化完成后进行提纯，取下肝脏，于4℃含Hank's液的平皿中剪碎、过滤，DMEM洗涤; 500 r/min离心2 min，弃上清，向沉淀肝细胞中加入4℃William'E培养液，制备成肝细胞悬液。

1.3相关指标观察

1.3.1肝细胞收获量、纯度、成活率两组均参照以往的研究［5］，采用血细胞计数板计算肝细胞收获量，PAS染色后计算纯度，0.4%台盼蓝染色后计算成活率。

1.3.2肝细胞功能取成活率90%以上的肝细胞，将密度调至5×105个/mL，接种于6孔板的William'E培养基中，37℃、5% CO2孵箱培养。最初4 h换液1次(采用有血清的培养基进行培养)，后改为24 h换液1次(采用无血清的培养基进行培养)。细胞无血清培养24 h后，收集上层清液，采用全自动生化分析仪检测白蛋白( ALB)、ALT。

1.3.3肝细胞LDH释放率细胞无血清培养24 h后，收集0.1 mL培养液，在碱性条件下用2，4-二硝基苯肼显色，采用紫外分光光度法于440 nm处读取LDH吸光度。再加入1 mL含70%乳酸钠基质液和0.2 mg的辅酶Ⅰ充分反应，获得相应细胞裂解液采用同样的方法检测其LDH吸光度。肝细胞LDH释放率=培养液LDH吸光度/相应细胞裂解液LDH吸光度×100%。

1.3.4肝细胞CLIC4 mRNA表达采用RT-PCR法。无血清培养24 h后，采用TRIzol试剂提取两组细胞总RNA，严格按照试剂盒说明书操作，并逆转录成cDNA。CLIC4及内参基因GAPDH的引物序列、扩增长度及退火温度见表1。30个循环后取PCR产物进行电泳，凝胶成像系统下观察并拍照。电泳条带密度=灰度×面积，CLIC4 mRNA相对表达以CLIC4与GAPDH电泳条带密度的比值表示。

表1　 CLIC4及内参基因GAPDH的引物序列、扩增长度及退火温度

1.3.5肝细胞CLIC4蛋白表达采用Western blotting法。提取两组细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。应用湿转膜法，稳流300 mA，2 h后将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，PBST洗3次。加入1∶2 000稀释的抗CLIC4多克隆抗体4℃过夜;洗膜后，加入1∶6 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体，于37℃条件下孵育1 h。再次洗膜后，用ECL发光试剂盒暗室显像，灰度扫描仪检测相应条带灰度及面积。以β-actin为内参，电泳条带密度=灰度×面积，CLIC4蛋白相对表达以

CLIC4与GAPDH电泳条带密度的比值表示。

1.4统计学方法采用SPSS13.0软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组肝细胞收获量、纯度及成活率比较见表2。

表2　两组肝细胞收获量、纯度及成活率比较(珔x±s)

2.2两组肝细胞功能及LDH释放率比较观察组与对照组ALB分别为( 43.8±5.0)、( 25.2±3.0) g/L，ALT分别为( 47.8±6.0)、( 104.3±11.7) U/L，LDH释放率分别为21.0%±2.7%、34.0%± 2.4%;两组比较，P均＜0.05。

2.3两组肝细胞CLIC4 mRNA及蛋白表达比较观察组与对照组CLIC4 mRNA相对表达量分别为1.01 ±0.02、1.62±0.01，CLIC4蛋白相对表达量分别为0.38±0.02、0.52±0.03;两组比较，P均＜0.05。

3　讨论

HCT是治疗严重肝衰竭、各种终末期慢性肝病和遗传性代谢性肝病的有效方法，选择最佳状态的肝细胞则是保证HCT成功的重要基础［1，2］。但肝细胞分离过程中普遍存在代谢及氧化应激损伤，为HCT术后移植肝细胞无功能或功能不良的重要原因之一。

在正常情况下，LDH只存在于细胞内。当代谢及氧化应激引起细胞膜损伤时，LDH就会被释放到细胞外。因此，细胞培养基中LDH水平可以反映细胞损伤严重程度［6，7］，LDH释放率被认为是判断细胞膜是否完整的重要标准［8］，而ALB水平降低以及ALT水平升高均可反映肝细胞功能损伤。本研究结果显示，与对照组比较，观察组ALB水平显著升高，而ALT水平、LDH释放率则显著降低。说明NPPB可减轻大鼠肝细胞分离造成的细胞膜结构和功能损伤，可能与NPPB抑制膜通透小孔的开放，抑制代谢及氧化应激引起的细胞膜对大分子通透性的增加，以及在一定程度上影响细胞膜功能作用方式和途径有关。但是两组肝细胞收获量、纯度及成活率比较无统计学差异，说明NPPB可能不影响肝细胞代谢及氧化应激的其他作用途径［9］。

CLIC家族是新近发现的、具有7个家族成员的细胞内氯通道。Berryman等［10］发现，CLIC4也可能在细胞周期内细胞骨架的形成中起着重要作用，说明CLIC4及其他CLIC蛋白调节细胞功能的机制可能与传统的氯通道有所区别。本研究结果显示，观察组CLIC4 mRNA及蛋白表达均明显低于对照组推测在肝细胞分离过程中，NPPB可能通过下调细胞CLIC4表达而在一定程度上减轻肝细胞分离造成的细胞膜结构和功能损伤，并不会影响分离细胞的收获量、纯度及成活率。

本研究从离子通道方面进行研究，为获得最佳状态的高活性肝细胞开拓了新的路径，同时也为临床获得高质量的游离肝实质细胞提供了新的理论依据。NPPB下调细胞CLIC4表达的具体机制还有待进一步研究，比如肝细胞分离过程中氯离子通道的开放是瞬间的还是相对持续的，其动作电位是如何产生又是如何损伤肝细胞的，以及NPPB的关键作用时间点等。

参考文献:

［1］Fisher RA，Strom SC.Human hepatocyte transplantation: world wide results［J］.Transplantation，2006，82( 4) : 441-449.

［2］Grondin M，Hamel F，Averill-Bates DA，et al.Wheat proteins en hance stability and function of adhesion molecules in cryopreserved hepatocytes［J］.Cell Transplant，2009，18( 1) : 79-88.

［3］Suh KS，Mutoh M，Gerdes M，et al.CLIC4，an intracelhlar chlo ride channel protein，is a novel molecular target for cancer therapy ［J］.J Investig Dermatol Symp Proc，2005，10( 2) : 105-109.

［4］Fernandez-Salas E，Suh KS，Speransky VV，et al.Mt-CLIC/CLIC4，an organellular chloride channel protein，is increased by DNA damage and participates in the apeptoticresponse to p53［J］.Mol Cell Biol，2002，22( 11) : 3610-3620.

［5］梁珊，李灼日.阿魏酸钠对分离过程中肝细胞活性、功能影响及机制探讨［J］.山东医药，2009，49( 34) : 9-11.

［6］张莹，付学军.1，5-二咖啡酰奎宁酸在肾上腺嗜铬细胞瘤细胞缺血再灌注损伤中的作用广东医学［J］.广东医学，2012，33 ( 14) : 2045-2047.

［7］Duan J，Yu Y，Li Y，et al.Toxic effect of silica nanoparticles on endothelial cells through DNA damage response via Chk1-depend ent G2/M checkpoint［J］.PLoS One，2013，8( 4) : 62087.

［8］Shih CL，Chi SI，Chiu TH，et al.Ethanol effects on nitric oxide production in cerebral pial cultures［J］.Alcohol Clin Exp Res 2001，25( 4) : 612-618.

［9］Meng X，Reeves WB.Effects of chloride channel inhibitots on H202 induced renal epithelial cell injury［J］.Am J Physiol Rena Physiol，2000，278( 1) : 83-90.

［10］Berryman MA，Goldenring JR.CLIC4 is enriched at cell-cell junc tions and colocalizes with AKAP350 at the centrosome and midbody of cultured mammalian cells［J］.Cell Motil Cytoskel，2003，56 ( 3) : 159-172.

收稿日期:( 2015-04-17)

通信作者简介:李灼日( 1959 -)，男，主任医师，研究方向为普通外科肝胆胰疾病的诊断及治疗。E-mail: lzr59@ hotmail.com

作者简介:第一梁珊( 1982-)，女，主治医生，研究方向为病理学。E-mail: liangshan5460@126.com

基金项目:湖南省科技厅重点资助项目( 2008sk2004)。

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0014-03

文献标志码:A

中图分类号:R329

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.005