肝脏X受体α对高糖所致心肌细胞凋亡的影响及其机制

成永霞，孙立新，张大伟，徐彪，郭素芬，刘贵波( 牡丹江医学院，黑龙江牡丹江570;牡丹江医学院附属红旗医院)

肝脏X受体α对高糖所致心肌细胞凋亡的影响及其机制

成永霞1，孙立新1，张大伟1，徐彪2，郭素芬1，刘贵波1
( 1牡丹江医学院，黑龙江牡丹江157011;2牡丹江医学院附属红旗医院)

摘要:目的观察肝脏X受体α( LXRα)对高糖所致心肌细胞凋亡的影响，并探讨其机制。方法将对数生长期的H9c2大鼠心肌细胞随机分为5组，空白组、低T0组、中T0组、高T0组分别用二甲基亚砜及5、10、20 μmol/L 的LXRα激动剂T0901317预处理12 h，高糖对照组不处理;之后低T0组、中T0组、高T0组、高糖对照组用33 mmol/L的高糖浸润24 h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blotting法检测细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相对表达量。结果空白组、低T0组、中T0组、高T0组、高糖对照组细胞凋亡率分别为10.67%±0.82%、29.53%±4.21%、19.76%±2.80%、15.15%±1.90%、34.09%±5.32%;多组间比较，P＜0.05;低T0组、高糖对照组与空白组比较，P均＜0.01;中T0组、高T0组与高糖对照组比较，P均＜0.05。与空白组比较，低T0组、中T0组、高T0组、高糖对照组Bcl-2表达均降低，Bax和Caspase-3表达均增加，P均＜0.05;与中T0组、高T0组比较，高糖对照组上述指标变化更明显，P均＜0.05;低T0组与高糖对照组上述指标比较，P均＞0.05。结论中、高浓度LXRα可抑制高糖所致的心肌细胞凋亡，其机制可能与降低Bax、Caspase-3表达和增加Bcl-2表达有关。

关键词:心肌细胞; T0901317;肝脏X受体;高血糖;细胞凋亡

糖尿病性心肌病是糖尿病的严重并发症［1，2］，高血糖是其独立危险因素［3，4］。肝脏X受体( LXRs)包括α和β两个亚型，是由配体激活的转录因子，属于核激素受体超家族［5～9］。近期研究发现，LXRs是人体中潜在的药理学靶受体，人工合成的LXRs激动剂被用于多种人类疾病的治疗［10，11］。T0901317(以下称T0)是一种人工合成的强效LXRα激动剂，已被证实可提高肥胖小鼠的胰岛素敏感性［12］，并改善2型糖尿病患者的病情［13］，可能与其抑制磷酸腺苷活化蛋白激酶释放而减弱高糖所致的内皮干细胞功能障碍有关［14］;但被T0激活的LXRα是否可以阻止高糖所致的心肌细胞凋亡尚未证实。2014年1～12月，我们对上述问题进行了研究，现分析结果并探讨其机制。

1　材料与方法

1.1材料H9c2大鼠心肌细胞由美国模式培养物保藏所提供; T0购自Cayman公司;细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司; Caspase-3一抗、Bax一抗、Bcl-2一抗均购自美国Sigma公司。

1.2细胞分组与处理H9c2细胞用杜氏培养液(包括5.5 mmol/L葡萄糖、10% FBS、100 U/mL盘尼西林和100 mg/mL链霉素)培养。将对数生长期的细胞随机分为5组，接种于24孔板，每孔做3个复孔，在孵育箱中于37℃、5% CO2条件下培养其中，空白组、低T0组、中T0组、高T0组分别用二甲基亚砜及5、10、20 μmol/L的T0预处理12 h，高糖对照组不处理，之后低T0组、中T0组、高T0组高糖对照组加入33 mmol/L的高糖(称取0.8 g葡萄糖溶解在200 mL含有10% FBS、1%青链霉素的DMEM低糖培养基中)浸润24 h。

1.3相关指标观察

1.3.1细胞凋亡率采用流式细胞仪。高糖浸润24 h后收集各组细胞，1 000 r/min离心5 min;吸除上清，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞。依次加入5 μL Annexin V-FITC、Propidium Iodide混匀，室温避光孵育15 min。上流式细胞仪，检测细胞凋亡率。

1.3.2细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达采用Western blotting法。抽提蛋白质并定量，SDS PAGE电泳，转印，封闭，孵育一抗、二抗，ECL底物发光;抗体剥脱，封闭，孵育内参抗体及其二抗，ECL底物发光。将胶片进行扫描，用Gel-Pro-Analyzer软

件分析，目标蛋白表达量以目标条带光密度与β-actin光密度的比值表示。

1.4统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组细胞凋亡率比较空白组、低T0组、中T0组、高T0组、高糖对照组细胞凋亡率分别为10.67%± 0.82%、29.53%±4.21%、19.76%±2.80%、15.15%± 1.90%、34.09%±5.32%;多组间比较，P＜0.05;低T0组、高糖对照组与空白组比较，P均＜0.01;中T0组、高T0组与高糖对照组比较，P均＜0.05。

2.2各组Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达比较见表1。

表1　各组Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达比较(相对表达量，珔x±s)

3　讨论

LXRα可以通过与靶基因启动子区域的LXR反应原件相结合而调节靶基因的转录，LXRα及其下游调控网络可能涉及了糖尿病心肌病的发生、发展。我们前期研究发现，糖尿病心肌病大鼠LXRα基因启动子区的甲基化显著，进一步证明了LXRα与糖尿病心肌病的发病有关［15］。

T0是一种强选择性LXRα激动剂，可增加血清LXRα水平［12］。本研究对心肌细胞进行T0预处理，观察LXRα对高血糖所致心肌细胞凋亡的影响。结果发现，高糖对照组细胞凋亡率显著高于空白组，说明高糖可以导致细胞凋亡率增加;中T0组、高T0组细胞凋亡率明显低于高糖对照组，而低T0组细胞凋亡率与高糖对照组比较无统计学差异，说明10、20 μmol/L的T0可有效抵抗高糖所致的心肌细胞凋亡，而5 μmol/L的T0则没有这种作用，可能是5 μmol/L的T0浓度太低，作用不明显。

Bcl-2/Bax蛋白家族是线粒体细胞色素C释放的调节蛋白。Bcl-2是抗凋亡蛋白，可阻止细胞色素C的释放，维持线粒体膜对蛋白质的不通透性; Bax则能够诱导细胞色素C的释放，加速细胞凋亡。本研究中，单独经高糖处理的心肌细胞Caspase-3、Bax表达增加，Bcl-2表达减少;而经10、20 μmol/L的T0预处理后的心肌细胞Bax、Caspase-3表达降低，Bcl 2表达增加，5 μmol/L的T0则没有这种作用。因此，被中、高浓度T0激活的LXRα可抑制高糖所致的心肌细胞凋亡，该作用与其降低Bax、Caspase-3表达和增加Bcl-2表达有关，提示T0具有防治糖尿病性心肌病的潜在药理学作用。

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收稿日期:( 2015-02-28)

通信作者:刘贵波，E-mail: lgb20073@163.com

基金项目:牡丹江医学院科学技术研究项目( ZS201311)。

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0028-02

文献标志码:A

中图分类号:R36

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.010