热量限制对大鼠血清支链氨基酸、芳香族氨基酸、甘氨酸水平的影响及意义

宫环，杨睿悦，韩怡文，孙亮，崔菊，张延，张恩毅，张铁梅(北京医院老年医学研究所，卫生部北京老年医学研究所，北京100730)

热量限制对大鼠血清支链氨基酸、芳香族氨基酸、甘氨酸水平的影响及意义

宫环，杨睿悦，韩怡文，孙亮，崔菊，张延，张恩毅，张铁梅
(北京医院老年医学研究所，卫生部北京老年医学研究所，北京100730)

摘要:目的观察热量限制( CR)对大鼠血清支链氨基酸［缬氨酸( Val)、异亮氨酸( Ile)、亮氨酸( Leu)］、芳香族氨基酸［酪氨酸( Tyr)、苯丙氨酸( Phe)］及甘氨酸( Gly)水平的影响，并探讨其与胰岛素敏感性的关系。方法将20只雄性SD大鼠随机分为观察组和对照组各10只，对照组给予自由饮食，观察组限制热量摄入为对照组的60%。喂饲12周后称取两组体质量及附睾旁脂肪垫质量;行胰岛素耐量试验，绘制血糖值曲线并计算曲线下面积。采用液相色谱串联质谱法检测两组血清Val、Ile、Leu、Tyr、Phe及Gly。结果观察组体质量、附睾旁脂肪垫质量均低于对照组，P均＜0.01。观察组血糖值曲线下面积为728.1±65.7，对照组为955.1±39.0，P＜0.01。观察组血清Ile、Leu、Tyr水平均低于对照组，Gly水平高于对照组，P均＜0.05。两组血清Val、Phe水平比较，P均＞0.05。结论CR可能通过升高大鼠血清Gly水平，降低Ile、Leu、Tyr水平而提高其胰岛素敏感性。

关键词:热量限制;胰岛素敏感性;支链氨基酸;芳香族氨基酸;甘氨酸;大鼠

Effects of caloric restriction on levels of serum branched chain amino acids，aromatic amino acids and glycine of rats

GONG Huan，YANG Rui-yue，HAN Yi-wen，SUN Liang，CUI Ju，ZHANG Yan，ZHANG En-yi，ZHANG Tie-mei
( Beijing Hospital and Beijing Institute of Geriatrics，Ministry of Health，Beijing 100730，China)

Abstract:Objective To observe the effects of caloric restriction ( CR) on levels of serum branched chain amino acids［valine ( Val)，isoleucine ( Ile)，leucine ( Leu)］，aromatic amino acids［tyrosine ( Tyr) and phenylalanine ( Phe)］and glycine of rats，and to investigate their relationships with insulin sensitivity.Methods Twenty male SD rats were randomly divided into the control group which was fed ad libitum and the observation group which was fed 60% of the food as in the control group.After 12 weeks，body weight was measured and insulin tolerance test ( ITT) was performed.Blood glucose value curve was drawn and wevcalculated the area under the curve ( AUC).The levels of Val，Ile，Leu，Tyr，Phe and Gly were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Results Both body weight and epididymal fat pad weight were lower in the observation group than in the control group ( all P＜0.01).AUC of blood glucose in the observation group was 728.1±65.7，and 955.1±39.0 in the control group，respectively ( P＜0.01).The serum concentrations of Ile，Leu and Tyr in the observation group were lower than those of the control group，and the concentration of Gly was higher ( all P＜0.05).No significant difference was found in the serum levels of Val and Phe between the two groups ( all P＞0.05).Conclusion CR increases the serum level of Gly，reduces the levels of Ile，Leu and Tyr，and thus it increases the insulin sensitivity.

Key words:caloric restriction; insulin sensitivity; branched chain amino acids; aromatic amino acids; glycine; rats

研究发现，血液中支链氨基酸( BCAAs)水平与肥胖、胰岛素抵抗或2型糖尿病的发病密切相关［1～3］;芳香族氨基酸( AAAs)和甘氨酸( Gly)等均为与代谢综合征有关的代谢因子［3］。近年来以胰岛素抵抗为特征的代谢综合征发病率逐年上升，热量限制( CR)是被证实可以预防其发生、发展的有效

手段［4，5］。2014年5～9月，我们观察了SD大鼠CR后血清BCAAs、AAAs及Gly水平的变化，并探讨其与胰岛素敏感性的关系，以期为代谢综合征的预防和治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料雄性8周龄SD大鼠20只，体质量242 ～282 g，购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司。缬氨酸( Val)、异亮氨酸( Ile)、亮氨酸( Leu)、酪氨酸( Tyr)、苯丙氨酸( Phe)及Gly标准品、色谱纯甲酸均购自美国Sigma-Aldrich公司，同位素内标物( Val-D8、Ile-D10、Leu-D3、Tyr-D4、Phe-D5和Gly-D5)均购自Cambridge同位素实验室，色谱纯乙腈购自美国Fisher公司。1200型高效液相色谱仪购自美国Agilent公司，API 4000 Triple Quadruple质谱仪购自美国AB SCIEX公司。

1.2实验动物分组与处理将20只SD大鼠按照随机数字表法分为观察组和对照组，各10只。两组均于清洁级环境下饲养，室内光照12 h昼夜循环，室温22～25℃;对照组自由饮食，观察组限制热量摄入为对照组的60%，共喂饲12周。

1.3相关指标观察

1.3.1体质量及附睾旁脂肪垫质量两组过夜禁食12 h后，称取体质量。用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，分离附睾旁脂肪垫并称其质量。

1.3.2胰岛素耐量两组禁食5 h后，腹腔注射胰岛素0.5 IU/kg，分别于注射即刻及注射后15、30、60、120 min取尾血，采用强生血糖仪及配套试纸条测定血糖值。采用GraphPad Prism 5.01软件绘制血糖值曲线，并计算曲线下面积( AUC)。

1.3.3血清氨基酸水平采用液相色谱串联质谱法。收集两组腹主动脉血，离心后取血清，－80℃保存。分别取0.05 mL标准系列溶液和血清样品，加入内标混合溶液0.05 mL、0.1%甲酸乙腈溶液0.4 mL震荡离心。吸取上清液0.05 mL于入样瓶中，室温下氮气吹干，加入0.1%甲酸水溶液0.2 mL，复溶后上机。采用Waters Shield C18色谱柱( 3.5 μm，2.1× 150 mm)，流动相为10%乙腈、含0.01%甲酸水溶液流速0.3 mL/min，柱温20℃。串联质谱采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气、加热气、气帘气和碰撞气分别为620.5、482.7、517.3和13.8 kPa，喷雾电压5 500 V，去溶剂温度700℃。以标准溶液氨基酸水平为X轴，氨基酸和相应内标峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析，将样品峰面积比代入标准曲线方程，参照Yang等［6］的方法计算血清Val、Ile、Leu、Tyr、Phe及Gly水平。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用独立样本t检验P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组体质量、附睾旁脂肪垫质量比较见表1。

表1　两组体质量、附睾旁脂肪垫质量比较( g，珔x±s)

2.2两组胰岛素敏感性比较两组各时点血糖水平比较见表2。观察组AUC为728.1±65.7，对照组为955.1±39.0;两组比较，P＜0.01。

表2　两组各时点血糖水平比较( mmol/L，珔x±s)

2.3两组血清氨基酸水平比较见表3。

表3　两组血清氨基酸水平比较( mg/L，珔x±s)

3　讨论

随着社会人口的老龄化和生活方式的改变，以胰岛素抵抗为特征的代谢综合征发病率逐年上升［7］。CR可以通过调节胰岛素信号通路、提高胰岛素敏感性等途径预防、延缓和减轻代谢综合征等衰老或肥胖相关疾病的发生、发展，但其机制仍未明了［7，8］。本研究结果显示，观察组体质量、附睾旁脂肪垫质量均显著低于对照组，表明CR模型建立成功。胰岛素耐量试验可间接反映胰岛素的敏感性［9］。本研究结果显示，观察组胰岛素耐量试验中胰岛素负荷120 min的血糖值及AUC均显著低于对照组;提示CR可显著提高大鼠的胰岛素敏感性同时也进一步证实本研究中CR模型建立成功。

早在1969年就有研究发现，肥胖、胰岛素抵抗

或2型糖尿病患者血液中BCAAs、AAAs等氨基酸水平升高［10］。Wang等［11］发现，血液中Phe和Tyr水平升高会使2型糖尿病的发病风险上升5倍。一系列研究表明，BCAAs、AAAs及其代谢产物与胰岛素抵抗及冠心病发病密切相关，且其相关性高于血清脂肪酸［1，12，13］。Xiao等［14］给小鼠喂饲Leu缺陷饲料，发现其胰岛素敏感性升高。本研究也显示，观察组血清Ile、Leu、Tyr水平均显著低于对照组。以上结果提示，血清Ile、Leu、Tyr水平降低可能与CR可提高胰岛素敏感性有关。此外，Hsiao等［15］用降糖效果不同的几种噻唑烷二酮类药物处理Zucker肥胖大鼠，发现其控制血糖效果与BCAAs分解代谢通路酶编码基因的调节能力增强相关。因此推测，CR可能调节了上述氨基酸代谢通路中的酶，从而改变这些氨基酸的水平。

与上述几种氨基酸相反，血液Gly水平在消瘦人群中高于超重及肥胖人群，代谢正常的健康人群高于代谢异常患者，说明血液中Gly水平升高表示个体处于健康状态，即Gly是保护性因素［3］。本研究观察组血清Gly水平显著高于对照组，提示CR可升高大鼠血清Gly水平，从而改善其代谢状态。

综上所述，CR可改变大鼠血清氨基酸谱的表达，而提高其胰岛素敏感性。本研究为代谢综合征患者的饮食干预治疗提供了理论依据。

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收稿日期:( 2015-04-09)

通信作者简介:张铁梅( 1953-)，女，博士、研究员，研究方向为生活方式干预的作用及机制。E-mail: tmzhang126@126.com

作者简介:第一宫环( 1977-)，女，博士、助理研究员，研究方向为热量限制的作用及机制。E-mail: huan0220@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 81300693) ;国家十二五科技支撑计划项目( 2012BAI10B01)。

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0011-03

文献标志码:A

中图分类号:R587.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.004