海马齿状回区D1受体激活对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的改善作用

万朋，高俊涛，王丹，王师，金清华

(1 吉林医药学院生理学教研室，吉林吉林 132013；2 延边大学医学院生理学与病理生理学教研室)



海马齿状回区D1受体激活对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的改善作用

万朋1，高俊涛1，王丹2，王师2，金清华2

(1 吉林医药学院生理学教研室，吉林吉林 132013；2 延边大学医学院生理学与病理生理学教研室)

摘要：目的观察海马齿状回(DG)区D1受体激活对血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆能力的改善作用。方法32只雄性SD大鼠，随机分为假手术组、VD模型组1、VD模型组2、VD模型SKF38393激动剂组，各8只，后三组制备VD模型，后两组采用脑部微量注射法于大鼠海马DG区分别注射生理盐水、D1受体激动剂SKF38393。应用Morris水迷宫进行大鼠学习记忆能力的行为学评估，HE染色法观察大鼠海马DG区病理组织形态学变化。结果 VD模型组1、假手术组逃避潜伏期分别为(75.73±4.41)、(50.13±4.48)s，两组比较，P<0.05。VD模型组1、假手术组穿越原站台区的次数分别为(2.67±0.67)、(7.67±0.88)次，两组比较，P<0.05。HE染色结果显示，VD模型组大鼠海马DG区神经元数量明显减少，可见坏死的神经元。VD模型组2和VD模型SKF38393激动剂组逃避潜伏期分别为(78.23±7.38)、(57.46±4.81)s，两组比较，P<0.05。VD模型组2和VD模型SKF38393激动剂组穿越原平台区的次数分别为(2.67±0.50)、(5.33±0.51)次，两组比较，P<0.05。结论 海马DG区的D1受体激活可改善VD大鼠受损的学习记忆能力。

关键词：血管性痴呆；海马DG区；D1受体；Morris水迷宫；学习记忆能力

血管性痴呆(VD)是一系列脑血管因素导致脑组织损害而引起的，以记忆、认知功能障碍为主要临床表现的智能损害综合征[1]。VD已成为全球第二大类型的痴呆[2]，预防和治疗VD已成为社会广泛关注的问题[3]。认知功能障碍是VD最显著的临床表现，海马是认知功能的关键脑区[4]，VD的认知功能障碍程度与海马萎缩相关[5]。海马齿状回(DG)区可能参与VD的空间学习和记忆障碍[6～9]。本课题组前期研究[10]证明，VD模型大鼠海马DG区的DA含量减少，但对DG内D1受体在空间学习记忆中的作用尚未见报道。为此，本实验观察了海马DG区D1受体激活对VD大鼠学习记忆能力的改善作用。

1材料与方法

1.1实验动物及分组成年雄性SD大鼠32只，体质量250～300 g，由延边大学实验动物科提供[许可证号：SCXK(吉)2011-0007]。将所有大鼠随机分为假手术组、VD模型组1、VD模型组2和VD模型SKF38393激动剂组，各8只。

1.2VD模型大鼠的制备VD模型组1、VD模型组2、VD模型SKF38393激动剂组大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)进行麻醉，颈部正中线左侧旁开0.5 cm处做一个长约1 cm的切口，分离颈总动脉后用医用4号手术丝线双重结扎。7 d后于颈部正中线右侧旁开0.5 cm处做一个长约1 cm的切口，分离颈总动脉用医用4号手术丝线双重结扎。假手术组除了不结扎双侧颈总动脉，其余步骤均与上述相同。各组动物术后单独饲养1周后合笼，并在模型制备完成30 d后进行模型的病理学和生理学的验证，确定模型建立成功后开始进行下一步实验[11]。

1.3SKF38393注射方法大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)行腹腔麻醉，手术根据Paxinos和Watson图谱进行脑部定位，以前囟为参考点，将透析用外套管垂直插入固定于一侧海马DG区(定位坐标为AP 3.2 mm，L/R 1.6 mm，H 2.5 mm)。然后用牙科水泥将套管固定在大鼠颅骨上。适应环境24 h后将微量注射探针植入外套管内进行实验。VD模型组2、VD模型SKF38393激动剂组分别在每天上午8时在大鼠海马DG区内注射1 μL的生理盐水和D1受体激动剂SKF38393，注射SKF38393的浓度为1 μg/μL，注射时间为1 min，30 min后进行Morris水迷宫训练。

1.4大鼠学习记忆能力检测利用Morris水迷宫观察所有大鼠的学习记忆能力，包括定位航行试验和空间探索试验。Morris水迷宫检测时，水池中水深约45 cm，水温保持在(22±2)℃，将直径10 cm的圆形平台放于任一象限的中心位置，并淹没于水面下约2 cm。定位航行试验时，若大鼠在120 s内找到站台，记录所需的时间作为逃避潜伏期；若大鼠在120 s内未找到站台，则将其引至站台并停留15 s，潜伏期记为120 s。大鼠每天训练1次，连续训练4 d。水迷宫检测第5天，进行空间探索试验，即撤去水池中的圆形平台，从同一个入水点将实验动物放入水中，测量大鼠在120 s内穿越原站台象限的次数。

1.5大鼠海马DG区病理组织形态学观察实验结束后，取假手术组、VD模型组1大鼠的脑组织，在4%多聚甲醛中浸泡固定。将海马组织用石蜡包埋，用切片机连续冠状切片，片厚4 μm，隔三取一，用常规HE染色法观察海马DG区病理组织形态，分别在200倍和400倍光学显微镜下观察海马DG区神经元形态结构。

2结果

VD模型组1、假手术组逃避潜伏期分别为(75.73±4.41)、(50.13±4.48)s，两组比较，P<0.05。VD模型组1、假手术组穿越原站台区的次数分别为(2.67±0.67)、(7.67±0.88)次，两组比较，P<0.05。HE染色结果显示，假手术组海马DG区神经元数量多，体积大，染色均一，结构完整，细胞膜、核膜清晰，核圆、核仁明显；VD模型组大鼠海马DG区神经元数量明显减少，细胞排列紊乱，细胞外空隙增大，多数神经元细胞核呈固缩状,胞质深染，细胞膜、核膜界限不清晰，可见坏死的神经元。

VD模型组2和VD模型SKF38393激动剂组逃避潜伏期分别为(78.23±7.38)、(57.46±4.81)s，两组比较，P<0.05。VD模型组2和VD模型SKF38393激动剂组穿越原平台区的次数分别为(2.67±0.50)、(5.33±0.51)次，两组比较，P<0.05。

3讨论

VD是由缺血、血管损伤出血、急慢性缺氧等一系列因素导致脑组织结构与功能广泛受损而引起的，以认知功能障碍为特征的获得性智能损害综合征，它具有发病率高、病死率高、致残率高等特点[12]。目前，基础研究主要是通过观察VD模型动物的相关行为，脑血流的变化，脑区细胞的形态、功能、生化等指标研究VD的发病机制[13]。利用双侧颈总动脉结扎法制备VD模型大鼠已广泛用于痴呆的相关研究[11]，改良双侧颈总动脉永久性结扎法在保持传统双侧颈总动脉结扎法优点的基础上，大大提高了模型动物的存活率和模型制备成功率。本实验利用改良双侧颈总动脉结扎法制备VD大鼠模型，并利用Morris水迷宫观察其空间学习记忆能力。本研究结果显示，在Morris水迷宫定位航行实验中，VD大鼠的平均逃避潜伏期明显长于假手术组；在Morris水迷宫空间探索实验中，VD大鼠穿越原平台区的次数明显少于假手术组，提示本实验制备的VD模型大鼠出现了空间学习记忆的损害。

海马是学习记忆功能的重要脑区，它直接参与信息的储存和再现过程，尤其在辨别空间信息、新异刺激和短时记忆向长时记忆的过度中起重要作用[14]。利用双侧颈总动脉结扎法制备VD大鼠模型时，随着时间的推移，早期的急性脑缺血因基底动脉环的血流调节和侧支循环的代偿而有所改善，脑血流量趋于稳定，但海马区得不到正常水平供血，造成慢性缺血，导致海马区神经细胞损伤，最终引起VD的认知障碍[15]。本实验VD大鼠海马DG区HE染色可见神经元数量明显减少，提示DG区神经元损伤可能是VD大鼠空间学习记忆损害的直接原因之一。同时本实验结果发现，在VD大鼠海马DG区微量注射D1受体激动剂SKF38393可明显提高大鼠的学习记忆能力。有研究[16]证明，激活海马内的D1受体能增加AMPA受体的表达，同时能修复损毁的海马神经元。通过前期的研究，我们认为激活D1受体可加强兴奋性氨基酸的兴奋传递过程，并减弱GABA的抑制作用，进而易化空间学习记忆过程，但其具体的下游机制有待于进一步研究。

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·基础研究·

收稿日期：(2015-08-10)

通信作者：金清华

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31160211)。

中图分类号：R743；Q427

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)47-0023-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.008