新型异喹啉类化合物12-4-Y对活化肝星状细胞凋亡的影响及其机制研究*

王军，李光明，仝艳艳，邓怡林，吴劼，范建高

新型异喹啉类化合物12-4-Y对活化肝星状细胞凋亡的影响及其机制研究*

王军，李光明，仝艳艳，邓怡林，吴劼，范建高

作者单位：200092上海市上海交通大学医学院附属新华医院消化内科（王军，李光明，范建高，仝艳艳，邓怡林）；复旦大学化学系（吴劼）

第一作者：王军，女，26，硕士研究生。主要从事肝损伤及肝纤维化的防治研究，E-mail: nalanxuehai@126.com

【摘要】目的探讨新型异喹啉类化合物12-4-Y[1-乙基-8-甲氧基-5苯基吡唑并（5，1-a）异喹啉]对大鼠肝星状细胞（HSC）凋亡的影响，并探讨其可能的机制。方法以不同浓度（5、10、20、40和80 μg/ml）12-4-Y处理HSC-T6细胞，分别于孵育后12h、24h、36h和48h收集细胞，以MTT法检测细胞增殖，以Hoechst染色对凋亡定性，以流式细胞分析对凋亡定量，应用Western blot检测凋亡关键蛋白Caspase3表达变化。结果12-4-Y处理12h可浓度依赖性（在5～80 μg/ml范围内）抑制HSC-T6细胞增殖，细胞增殖率分别为（1.086±0.013）、（1.055±0.019）、（0.957±0.012）、（0.793±0.021）和（0.553±0.031），均显著高于对照组水平（1.215±0.014，P<0.05）；12-4-Y（20μg/ml）处理可时间依赖性抑制HSC-T6细胞增殖，在12 h、24 h、36 h、48 h，细胞增殖率分别为（0.957±0.012）、（0.852±0.024）、（0.641±0.032）和（0.492±0.017），与对照组（1.318±0.007，P<0.01）差异具有显著性；12-4-Y（20μg/ml）处理24h时，Hoechst染色显示HSC-T6可见明显凋亡小体，流式细胞分析显示凋亡率为（29.23±1.20）%，显著高于对照组[（5.47±1.39）%，P<0.001]；蛋白质印迹显示凋亡关键蛋白Caspase3的裂解产物表达亦显著增加。结论新型异喹啉类化合物12-4-Y可显著诱导活化HSC凋亡，其机制与激活凋亡关键蛋白Caspase3有关。

【关键词】肝星状细胞；异喹啉类化合物；凋亡；凋亡小体

既往研究表明，异喹啉类化合物具有抑制星形胶质细胞增殖[1]，诱导前列腺癌细胞、肝癌细胞和骨肉瘤细胞凋亡等多种生物学活性[2～6]。近来，亦有研究证实异喹啉类生物碱可诱导HSC凋亡，从而能逆转或延缓肝纤维化的进展[7，8]。1-乙基-8-甲氧基-5苯基吡唑并（5，1-a）异喹啉（12-4-Y）是一种新型的异喹啉类小分子化合物，本研究旨在探讨12-4-Y对肝HSC增殖及凋亡的影响，以明确12-4-Y潜在的抗肝纤维化的作用及其机制。

1　材料与方法

1.1细胞、仪器与试剂大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞购自美国典型培养物中心（American Type Culture Collection，ATCC），全波长酶标仪（Bio-TEK公司），DMI300B型倒置荧光显微镜（Leica公司），FACS cantoⅡ检测型流式细胞仪（BD公司），Chemi Doc XRS凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。本研究所选用的12-4-Y是从复旦大学化学系合成的“类天然产物”化合物库中筛选出来的，用DMSO配制成200 μg/ml

浓度的原液，用含有10%FBS的DMEM高糖培养基稀释成200 μg/ml浓度的母液，0.22 μm的无菌滤器过滤除菌后4℃保存备用，临用前用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基稀释至所需浓度。DMEM（高糖）培养基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA购自美国Gibco公司；6孔培养板、24孔培养板、96孔培养板购自美国Corning Costar公司，FITC Annexin V凋亡检测试剂购自美国BD公司；兔抗鼠Caspase3单克隆抗体购自美国Cell Signal Technology公司；Millipore ECL发光液购自德国Merck公司；变性型裂解液、Hoechst33342染色液、二抗检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所，其余试剂均为国产分析纯。

1.2细胞的培养取大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞，置于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中常规培养，隔天换液，待细胞长至80%~90%密度时，用0.02%EDTA 和0.25%胰蛋白酶消化，按1:4传代。取对数生长期的细胞，计数后接种于96孔培养板（8000个/孔）、24孔培养板（1×105个/孔）和6孔板（5×105个/孔），放入二氧化碳培养箱中孵育16～24h，待细胞贴壁后处理细胞。

1.3 HSC-T6细胞增殖检测采用MTT法，取HSCT6细胞接种于96孔板，以2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml和80 μg/ml 12-4-Y处理贴壁培养的HSC-T6细胞，同时设空白对照组，分别于孵育后12 h、24 h、36 h和48 h，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，37℃继续孵育4h，弃MTT，加入DMSO150 μl，37℃孵育10 min，于波长562 nm 测OD值。采用台盼蓝染色进行细胞活力评估。

1.4凋亡小体检测采用Hoechst染色法，取HSC-T6细胞，接种于24孔板。根据台盼蓝染色和MTT检测筛选的结果，选用细胞毒性小及抑制效果明显的3个药物作用浓度（5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml）处理HSC-T6细胞24 h，设空白对照组。然后，弃培养基，以DPBS洗1遍，加入4%多聚甲醛固定15 min，以DPBS洗2遍，每次3min，加入适量的Hoechst染色液对凋亡细胞及细胞核进行染色[9～11]，室温避光孵育20 min，DPBS洗2遍，每次3min，在荧光倒置显微镜下观察并拍照。

1.5细胞凋亡定量分析取HSC-T6细胞，接种于6孔板，分别予以5 μg/ml、10 μg/ml和20 μg/ml浓度的12-4-Y处理HSC-T6细胞24 h，设空白对照组。分别收集各组细胞，1000 r/m离心5 min，弃上清液，用冷的DPBS洗涤2次，并在含有Ca2+的染色缓冲液中以1×106/ml重悬细胞。在室温下，吸取100μl细胞（1×105）至试管中，设置空白对照组、空白单标组（AnnexinⅤ-FITC）或碘化丙啶（PI），其余各组分别加入AnnexinⅤ-FITC染液和PI各5 μl，轻轻混匀，37℃下避光孵育15 min，加入400 μl的结合缓冲液，混匀后，30 min内上流式细胞仪检测。

1.6细胞Caspase3及其活化形式的检测取HSC-T6细胞，接种于6孔板，分别予以5 μg/ml、10 μg/ml 和20 μg/ml浓度的12-4-Y处理HSC-T6细胞24h，设空白对照组。分别收集各组细胞，提取总蛋白，进行Caspase3及活化的Caspase3蛋白表达情况的检测。主要步骤如下：以RIPA裂解液裂解各组细胞（1×107细胞/ml），加入蛋白酶抑制剂PMSF 10 μl/ml，冰上静置15 min，15000 r/m 4℃离心15 min，取上清，转入新的EP管中，用蛋白质定量试剂对每个样品的总蛋白进行定量，加入5×SDS凝胶电泳上样缓冲液，沸水浴5min，待蛋白样品变性后置于-80℃保存。取各组总蛋白60 μg，灌制12%SDS-PAGE分离胶和4%浓缩胶，加样，80 v电泳至分界处，换成120 v直至溴酚蓝跑至胶底部；300 mA、40 min转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用含5%脱脂奶粉、0.1%Tween20的TBST封闭液室温下封闭2 h；将PVDF膜在含有各抗体的一抗稀释液（1:1000）中4℃孵育过夜。同时使用小鼠抗大鼠Tublin单克隆抗体（1:1000）孵育作为对照；置于洗膜液（含0.1%Tween20的TBS）中洗膜3次，每次10 min；将膜置于HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）或山羊抗小鼠IgG（H+L）的二抗稀释液（1:1000）中在摇床上震荡孵育2h；洗膜液洗膜3次，每次15min。暗室中将膜加上ECL发光剂，铺上保鲜膜，在化学发光成像系统中检测。

1.7统计学处理应用SPSS11.0软件包进行统计学分析，所有数据进行正态性及方差齐性检验，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用Turkey's检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1 12-4-Y可明显抑制HSC-T6细胞增殖MTT检测结果显示，在12～48h内，2.5～80 μg/ml 12-4-Y 对HSC-T6细胞增殖的抑制呈浓度及时间依赖性增加（图1），与对照组比，在5～40 μg/ml范围内其作用具有显著性差异。台盼蓝染色结果显示，与对照组比，12-4-Y在40 μg/ml以上和20 μg/ml孵育24h可诱导细胞活力明显下降，漂浮细胞增加，差异具有显著性（P<0.05）；在其余浓度及孵育时间组，12-4-Y处理组与对照组相比，细胞活力下降无显著性差异。

2.2 12-4-Y可诱导HSC-T6细胞凋亡经Hoechst染色显示，孵育24 h，与对照组比，5～20 μg/ml 12-4-Y均可明显诱导细胞出现凋亡小体（图2），表明12-4-Y可诱导HSC T6凋亡。

2.3凋亡定量情况流式细胞分析是一种细胞凋亡的定量评估方法，并可区分早期凋亡和晚期凋亡。在流式细胞仪分析中，2象限提示晚期凋亡和坏死细胞，4象限提示早期凋亡。经流式细胞分析显示，在孵育24 h时，5～20 μg/ml范围内12-4-Y作用下，细胞凋亡呈浓度依赖性增加；与对照组比，在5～20 μg/ml浓度范围内，细胞凋亡增加具有显著性差异，并显示20 μg/ml较5～10 μg/ml浓度作用造成早期凋亡比例明显增加，20 μg/ml12-4-Y作用下，细胞总凋亡率为（29.2±1.2）%，与对照组（5.47±1.39）%相比，差异具有统计学意义（P<0.01，图3）。

2.4 12-4-Y可诱导活化的Caspase3表达上调Caspase3是一种凋亡关键蛋白，cleaved caspase3是Caspase3的活化形式。经Western blot检测显示，与对照组比，12-4-Y可明显上调活化Caspase3表达，表明12-4-Y诱导的HSC-T6细胞凋亡可能与活化caspase3有关（图4）。

3　讨论

活化的HSC清除障碍是肝纤维化持续进展的主要原因，诱导活化的HSC凋亡是防治肝纤维化的一种有效策略[9~12]。异喹啉生物碱具有明显诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖、抗炎等多种作用[13，14]。通过对异喹啉类生物碱改造修饰，保留其促凋亡活性并降低细胞毒性，有望创造出一类新型抗肝纤维化药物的先导化合物。

我们先前从近200种异喹啉生物碱中初筛出对HSC-T6细胞增殖具有明显抑制作用的12-4-Y，为了评估12-4-Y对HSC-T6细胞凋亡的影响，我们应用Hoechst染色对细胞凋亡进行定性，流式细胞分析对细胞凋亡进行定量，从而进一步证实12-4-Y在5～20 μg/ml浓度孵育24 h可浓度依赖性诱导细胞凋亡，20 μg/ml孵育24 h时细胞凋亡率达到近30%。Caspase3活性裂解产物的同步增加进一步论证了凋亡的存在，并提示12-4-Y诱导的HSC-T6细胞凋亡与激活凋亡关键蛋白Caspase3有关[15，16]。

文献报道，诱导活化的HSC凋亡是粉防己碱抗肝纤维化重要的作用机制之一。通过对异喹啉类天然活性成分进行修饰，进而合成毒性低而生物活性强的新型异喹啉小分子化合物，可能是探寻抗肝纤维化先导化合物的一种有效方法。

我们的研究筛选到一种新型异喹啉类化合物（12-4-Y），发现12-4-Y诱导HSC凋亡的有效浓度，证实并初步阐明了12-4-Y诱导HSC凋亡的机制与激活凋亡关键蛋白Caspase3有关，提示12-4-Y有潜力成为一类新型抗肝纤维化先导化合物。

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（收稿：2014-12-02）

（本文编辑：陈从新）

·实验性肝炎·

Mechanism of 12- 4- Y，a novel isoquinoline compound，on apoptosis of activated hepatic stellate cells in

vitro

Wang Jun，Li Guangming，Tong Yanyan，et al. Department of Gastroenterology，Xinhua Hospital Affiliated to

Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

【Abstract】Objective To study the mechanism of 12-4-Y[1-ethyl -8- methoxy -5 phenyl pyrazole（5，1-a）isoquinoline]，a novel isoquinoline compound，on apoptosis of activated rat hepatic stellate cells（HSCs）in vitro. Methods HSCs-T6 cells were treated with 12-4-Y at different concentrations（5，10，20，40 and 80 μg/ml）for 12 h，24 h，36 h and 48 h，respectively. Cell proliferation was determined by MTT assay. Qualitative and quantitative cell apoptosis were measured by Hoechst staining and flow cytometry（FCM），respectively. The expression of caspase 3 and its active form were detected by Western blotting. Results The proliferation rates of HSC-T6 cells when incubated with 12-4-Y for 12 hours were dose-dependent decreased[（1.086±0.013），（1.055±0.019），（0.957±0. 012），（0.793±0.021）and（0.553±0.031），significantly lower than that in control group（1.215±0.014），P<0.05 for all]；the time-dependent inhibition of cell proliferation was observed when the incubation concentration of 12-4-Y at dose of 20 μg/ml was fixed[（0.957±0.012），（0.852±0.024），（0.641±0.032）and（0.492±0.017）at 12 h，24 h，36 h and 48h，significantly lower than that in the control group（1.318±0.007），P<0.01 for all]；In cells treated with 20 μg/ml for 24h，the apoptotic rate revealed by flow cytometry analysis was（29.23±1.20）%，which was significantly higher than that in the control group [（5.47±1.39）%，P<0.001]and Hoechst staining showed obvious apoptotic bodies in HSCs-T6 cells，in addition，Western blotting analysis revealed increased expression of cleaved caspase3 compared with in the control group. Conclusion 12-4-Y has great potential in inducing HSCs apoptosis and the activation of caspase3 might be involved in this process.

【Key words】Hepatic stellate cells；Isoquinoline compound；Apoptosis，Apoptosis body

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.003

通讯作者：李光明，E-mail: ligm68@126.com

*基金项目：国家自然科学基金资助项目（81070344）；中国肝炎基金会王宝恩肝纤维化研究基金资助项目（200090007）