病理石蜡标本基因检测中D N A提取(离心柱型)的几点体会

陈顺平，苏海燕，吴文乔

(福建医科大学附属漳州市医院病理科，福建 漳州363000)

随着分子生物技术在临床中开展，其所覆盖的检测疾病的范围越来越广，不仅在常规医学检验中，近年来随着临床靶向治疗的普及，病理肿瘤标本的相关基因检测也得到发展。然而，什么样的病理标本适合做基因检测？怎么才能够得到更多更好的DNA呢？是目前我们病理科开展此项目所面对的问题。经过我们不断实践，现将几点体会介绍如下。

1 标本及时合适的固定是石蜡标本基因检测的关键步骤

活组织或脱落细胞应得到及时且合适固定液固定，一般活组织离体30 min内冻存或10%中性缓冲福尔马林固定，脱落细胞应及时离心，-80℃保存或用棉絮纸包裹，按组织常规处理。合适固定液及时固定可以大大降低DNA的降解，减少基因的片段化，同时避免使用含重金属固定液，如Bouin液等。若标本固定不佳，在后期的标本制备过程则无法加于纠正。临床送检组织标本时间与固定后标本取材时间之差最好统一，一般为6～48 h为好[1,2]。活检小标本一般为6～12h，组织大标本为6～48h且按要求剖开固定，保证标本充分固定，有效保护细胞中DNA质量，提高DNA提取效率，保证检测结果的可靠性。

2 足够的肿瘤细胞是石蜡标本基因检测的必备要求

足够的肿瘤细胞是基因检测DNA提取的基本条件，也是必备要求。在挑取肿瘤组织蜡块时，应充分地考虑肿瘤细胞数量、组织类型及避开坏死组织等。在提取标本DNA时一般应首先进行病理评估，了解肿瘤细胞的数量、肿瘤细胞百分比及组织类型，如达不到病理评估的要求则应终止下游基因检测，符合要求进行下游检测。实际过程中我们可在切取病理石蜡标本做DNA提取时切一张白片用于HE染色于判断肿瘤百分比及肿瘤细胞数。如该标本已行免疫组化检测时不能将用于常规病理诊断的HE染色制片中肿瘤细胞分布情况用于病理评估，在切取标本提取DNA时再切一张白片用于染色，以免免疫组化检测后肿瘤细胞数量不足，特别是活检小标本。肿瘤细胞含量的最小比例应由不同检测方法的敏感度决定，专家共识认为要求肿瘤细胞数一般要求大于200个，且肿瘤细胞应占整张切片所有细胞10%以上[2]。实际操作中应尽量刮取肿瘤细胞丰富的区域且避开坏死或红细胞较多的区域用于DNA的提取，可以提取到高质量相关DNA，特别是测序技术，同时可降低PCR扩增抑制物的存在。手术根治标本是我们病理基因检测的最好标本，肿瘤细胞较多、含量比例高。相反，活检小标本一般肿瘤细胞数偏少。如肿瘤细胞数量不够，可多切组织切片弥补肿瘤细胞不足，但应保证肿瘤细胞占整张切片所有细胞10%以上，如肿瘤细胞所占比例小于10%，组织标本应脱蜡后切除无关细胞已达到要求，这样肿瘤细胞提取相关DNA质量仍好。同时应对病理评估结果做好记录，方便与DNA提取结果进行比较，累积经验。

3 D N A提取是石蜡标本基因检测的前提条件

3.1 标本的选择 一般选择病理组织蜡块保存时间越短越好。组织标本经过福尔马林固定，可引起组织蛋白与核酸交联反应。石蜡组织标本保存时间越长，核酸片段化越严重，加剧核酸甲基化修饰，核酸提取质量越差，浓度偏低[3]。保存时间长的标本切片时应尽量切掉与空气接触的外层组织再切取组织进行DNA提取，特别是未行封蜡的组织蜡块。

3.2 标本的处理 石蜡标本在进行切片前，应将切片机清洁干净，可用75%乙醇消毒台面及镊子等。每个标本应选择一个刀口，严格控制标本间交叉污染。手术根治标本最好选择5μm～10μm切片黏附载玻片上，脱蜡完后用手术刀转移组织，简便、省时；而活检小标本可以选择EP管收集连续切片，管内脱蜡，达到尽可能收集肿瘤细胞。在进行组织切片时不建议厚度超过10μm或低于5μm，过厚组织切片会增加脱蜡的困难，也增加细胞酶消化和裂解的难度；过薄则容易产生DNA断裂。如选择EP管二甲苯脱蜡时乙醇去除二甲苯后，应晾干方可进入下一步骤，残存有机溶剂会降低提取率及后续扩增效率。对于EP管脱蜡，应关注EP管底至少有肉眼可见的样本存在，以保证足够DNA用于下游检测。

3.3 DNA的提取 DNA提取一般情况下应严格按照本实验室的SOP文件执行，然而在实际操作过程中往往要对不同情况进行针对性处理，才能获得比较满意的结果，笔者归纳如下。

3.1 酶及裂解 实验中标本消化一般用蛋白酶K，其浓缩粉末可室温15~30℃保存，分装完应放入-20℃保存。DNA提取操作中首先温度设定为56℃蛋白酶K的消化及裂解过程，最佳工作消化时间视标本而定，不同的标本一般不一样[4]。过量的标本含量将影响酶的消化及裂解效果，标本含量越多消化及裂解时间应越长，酶消化完成后应检查酶消化效果，如还有很明显的组织漂浮物应说明样本加入量偏大应适度延长酶消化时间。适量加大酶量或延长消化时间有助于加强消化裂解作用[5,6]。蛋白酶K消化一定要满足DNA释放完全有效，保证以满足后续实验需要DNA的量[7]。蛋白酶K消化裂解后进入90℃灭活，此阶段裂解液对修饰DNA及释放DNA进一步发挥作用。

3.2 DNA洗涤 DNA洗涤液使用前按要求加入无水乙醇，使其成为合格的DNA洗涤液，否则造成DNA柱上流失，大大降低其浓度。DNA洗涤时将洗涤液静置时间应严格控制，保证洗涤液与核酸有充分的反应时间，提高标本DNA洗涤效果。

3.3 DNA洗脱 洗脱液pH不合适，将会减少DNA提取效率，应确保洗脱液pH值在7.0～8.5之间。为了提高DNA洗脱效率，可在加入洗脱液后在室温静置至少3min以上，肿瘤细胞偏少应5min以上，再按要求离心。加入洗脱液量可根据我们病理评估及基因检测要求量的结果适度加减，超过200μl洗脱体积所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。建议活检小标本DNA洗脱液体积应小于 100μl。

4 D N A定量

提取的DNA应经过定量以保证足够适量的DNA含量用于下游突变检测。DNA提取后应立即进行DNA浓度测定，随后存储DNA样本。可利用分光光度计在260nm处光密度值和银光染料法DNA总量检测，OD260nm/OD280nm比值可直观判断基因的纯度，一般值为1.8～2.0较好，该方法较简便，但无法评估可扩增的DNA片段和PCR抑制物。若DNA含量的确不符合检测要求应终止进一步检测，以节约成本和时间。

综上所述，在病理石蜡标本基因检测DNA提取中，我们应尽量了解每个步骤的作用以及学会如何控制石蜡标本DNA提取的关键点，这是对石蜡标本基因检测的操作者必备要求，也是如何防止假阳性假阴性结果的出现而采取了质量保证措施，同时也是我们病理科开展基因检测项目前提[8]。

[1]中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组.中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识[J].中华病理学杂志,2011,40(10):700-702.

[2]卫生部病理质控与评价中心,结直肠癌KRAS基因突变检测专家组.中国结直肠癌KRAS基因突变检测专家共识[J].中华病理学杂志,2012,41(9):635-636.

[3]李丹,刘亚丽,刘静,等.石蜡组织存放时间对提取DNA质量的影响[J].河南大学学报(医学版),2014,33(1):9-13.

[4]陈顺平.FISH中酶消化细胞的几点体会[J].临床与实验病理学杂志,2010,26(1):116-117.

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[6]王卡娜,李红芳,杨爱宏.等.石蜡包埋组织中DNA提取方法的比较[J].中国实验诊断学,2009,13(6):753-756.

[7]张玲玲,刘月平,王永军,等.石蜡包埋组织基因组DNA提取的条件优化[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(9)：1021-1023.

[8]李金明.实时荧光PCR技术[M].北京:人民军医出版社,2009:383.