肝干细胞及其应用的研究进展

王政禄，郑虹（.天津市第一中心医院病理科，天津 3009；.天津市第一中心医院器官移植中心，天津市器官移植重点实验室，天津 3009）

肝干细胞（hepatic stem cell，HSC）是一类具有同时向肝细胞及胆管细胞分化和增殖以及自我更新潜能的原始细胞，当肝实质损伤尤其是肝脏大部分切除后，HSC会发生分化和高效增殖，参与到肝脏的再生和修复过程中，为机体细胞的更新提供潜在的无限细胞来源。相对于手术而言，HSC治疗具有损伤小、并发症少的优势，为终末期肝病的治疗提供了崭新的思路［1］。本文就HSC的研究和治疗进展进行综述。

1 HSC的分类

目前认为，HSC按照其来源可分为肝源性和非肝源性两种。肝源性HSC来源于前肠内胚层，在胚胎发育过程中以胚胎肝细胞形式存在，在成年哺乳动物中以胆管源性肝卵圆细胞形式存在，包括肝卵圆细胞（hepatic oval cell，HOC）、小肝细胞和成熟肝细胞（maturity hepatocyte，MH）。非肝源性HSC主要来源于胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）、骨髓造血干细胞和胰腺干细胞等［1-2］。

1.1 肝源性HSC

1.1.1 HOC：Farber 1956年将肝内具有分化潜能的细胞描述为卵圆细胞。当肝实质细胞严重受损和（或）肝功能紊乱时，HOC被激活，进一步增殖、分化成肝细胞和（或）胆管细胞，从而完成肝脏结构和功能的重建［3］。目前，普遍认为HOC是肝祖细胞，但对其来源、增殖、调控分化及其与肝脏疾病的关系仍缺乏深入了解。研究发现，HOC与骨髓干细胞有许多相同的表面标志物，如Thy-1、Flt-3R、c-Kit、CD34等，提示HOC可能来源于骨髓［4-5］，但也有学者认为HOC来源于肝脏非实质细胞［6］。

1.1.2 小肝细胞样祖细胞（small hepatocyte-like progenitor cell，SHPC）：SHPC为直径 9 ～ 12 nm 的单核细胞，其形态介于肝细胞与胆管上皮细胞之间，多在肝脏严重受损的情况下出现。胚胎发育晚期肝祖细胞首先分化为SHPC，然后在细胞外基质及相关因子作用下分化成熟，成体肝脏HOC先分化为SHPC，再进一步分化为成熟的肝细胞［7］，Sasaki等［8］认为SHPC是可以分化成为成熟肝细胞的定向祖细胞，在培养基中可以选择性增殖，因此推测SHPC可能是肝细胞的特异性祖细胞。

1.1.3 MH：以往认为MH为终末细胞，但近年来研究发现，MH是具有增殖和分化潜能的干细胞。MH在体外培养中，在一定条件下可表达不同胚层（间叶、神经和造血）前体细胞标志物，如CK7、连接蛋白43（connexin 43）、NCAM、AFP、nestin和Thy1，表明其具有巨大的可塑性和分化潜能［9］。有研究显示，MH可自我复制70次以上，而且具有归巢能力［10］。

1.2 非肝源性HSC

1.2.1 ESC：ESC为增殖能力最强的全能干细胞，是一种高度未分化细胞，能诱导分化为3个胚层的各种细胞。Teratani等［11］在诱导因子作用下将小鼠ESC分化为有功能的MH，并移植到小鼠肝损伤模型体内，通过荧光示踪剂发现移植细胞广泛分布于损伤的肝脏内，并大量增殖。Shraki等［12］研究也表明，在不同的培养条件下，ESC可以分化为肝细胞。目前，人ESC向肝脏分化多采用拟胚体法（EB）［13］，其最大的特点是具有空间三维结构，与胚胎发育过程相仿，但EB的分化随机性较强，肝细胞诱导效率不高［14］。Malhi等［15］从人胎肝中分离出一种上皮祖/干细胞，它具有很强的集落形成能力，在培养条件下可增生数月，而且细胞分裂40次以上仍能保持正常核型，在联合免疫缺陷小鼠体内可分化为MH。

1.2.2 骨髓干细胞：目前的研究发现，骨髓干细胞至少包括两种类型干细胞：造血干细胞和骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC），它们在特定条件下可分化为多功能祖细胞（multipotent adult progenitor cells，MAPC），进而分化成不同种类的细胞，如肝细胞、神经细胞、心肌细胞和骨骼肌细胞等［16］。研究显示，BMSC具有体外易获得、来源可靠、免疫原性较弱且移植后不易发生免疫排斥反应等优点［17-18］。BMSC可迁移、归巢至肝细胞内，定向分化为有功能的肝样细胞和胆管细胞，参与肝脏的损伤修复、细胞更新和功能重建等病理生理过程［19-20］。BMSC可通过调解多种细胞信号转导通路、抑制肝星状细胞增殖及活化、促使基质金属蛋白酶（MMP）高表达，从而抑制胶原合成、降解细胞外基质、减轻肝纤维化，以改善肝功能［21］。此外，BMSC还能分泌白蛋白，使血清中白蛋白水平升高［22］。BMSC来源充足，可直接来源于成人的骨髓或外周血，采集方便，且自体移植不存在伦理上的争议，因此是干细胞移植的理想选择［23］。有研究表明，BMSC不仅能通过再生细胞来恢复肝细胞代谢功能，还能分泌MMP来降解肝脏间质纤维组织，改善肝脏纤维化和肝硬化［24］。姜雪明等［25］研究显示，BMSC疗法在临床移植领域中是一项很有前途的治疗策略，由BMSC分泌的吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）是促进调节T细胞生成和延长移植物存活的关键因素。

1.2.3 其他来源干细胞：其他来源干细胞包括胰岛祖细胞、唾液腺祖细胞等［1］。Burke 等［26］利用地塞米松体外诱导胰岛祖细胞表达肝蛋白，并转分化为肝细胞，提示在胚胎发育过程中，一些原始的多能干细胞以未分化状态滞留在机体组织中。

2 HSC的采集与疾病治疗

2.1 HSC的分离和采集：目前，临床上最常用的是BMSC治疗终末期肝病，BMSC的提取和分离是治疗的前提，供体细胞的质量则直接影响治疗效果。BMSC的提取通常在髂前上棘或髂后上棘进行，抽取骨髓50 ～ 100 ml，并以4 000 U肝素抗凝。BMSC的分离方法有负收集混合法、流式细胞仪法、Percoll法、贴壁筛选法、密度梯度离心法和免疫磁珠分离法等。Percoll法和免疫磁珠分离法是两个最常用的方法［24］。Percoll法的原理是将蛋白酶选择性地与非靶细胞结合，使非靶细胞表面活性发生变化，细胞密度发生改变，利用密度梯度离心方法分离所需细胞，其优点是不损伤干细胞，表面无任何标志物，能完整保持干细胞活性，是目前值得推荐的方法之一。免疫磁珠分离法是利用磁珠颗粒活性基团在一定条件下与细胞表面特异性标志物结合及解离的原理，将BMSC分为阴性细胞和阳性细胞。收集CD45细胞，锥虫蓝拒染计数免疫磁珠分离前后细胞活力［27］，其优点是干细胞回收率高、纯度好、能保障足够的细胞数目及细胞活力，在临床应用中取得了理想的治疗效果。

2.2 HSC的移植途径：BMSC移植治疗肝损伤的途径很多，包括肝动脉注射、门静脉注射、脾脏内或腹腔内移植等，临床上以肝动脉注射最为常用。影像引导下腹膜腔穿刺移植的优点是创伤较小、移植细胞数量多，缺点是BMSC在腹腔内较难存活。经皮肝内静脉穿刺套管插入术是在超声、CT或透视引导下经皮穿刺到肝内门静脉，造影明确后引入套管，同时缓慢输注移植细胞，注射细胞期间密切监测门静脉压力，注射完毕后给予肝素抗凝以防止门静脉血栓形成，术后给予以凝血酶饱和的海绵栓塞穿刺针道。经门静脉注射BMSC符合肝脏组织学及生理学特点，与其他途径相比，细胞更易进入肝窦；从生理学角度看，门静脉是肝脏的营养静脉，门静脉血中的营养成分对BMSC有益，肝脏本身的微循环也可以调节其分化，但移植细胞可能导致门静脉栓塞。为降低门静脉栓塞等并发症的发生率，需要对 BMSC 的数量进行控制［28-29］。Salama等［30］报道了48例经皮穿刺肝内门静脉插管移植HSC的患者，其中42例1次穿刺成功。目前，肝动脉介入插管技术已日臻成熟，通过该途径可方便地将分离纯化后的BMSC悬液直接输注至肝脏，其优点是符合介入移植的动脉插管途径，而且不受细胞浓度及数量的影响，因此，国内临床多采用此途径［31-33］。

2.3 HSC与肝脏疾病治疗

2.3.1 急慢性肝功能衰竭（肝衰竭）：急慢性肝炎、肝硬化等导致的急慢性肝衰竭发生率和病死率较高。目前，肝移植仍然是治疗终末期肝病的主要治疗措施，但供体缺乏、费用较高等因素限制了其应用，行HSC移植治疗成为最佳治疗手段。骨髓HSC已经开始临床应用研究，特别是BMSC，因其具有体外易得、来源可靠、免疫原性较弱且移植后不易发生免疫排斥反应等优点，无论是在动物实验，还是人体BMSC体外培养及临床应用研究中均取得了较好的效果［34-35］。该治疗手段能够减轻肝纤维化，促进肝功能恢复，修复肝损伤，发挥免疫调节功能［36-37］，故成为治疗肝病的研究热点。

2.3.2 代谢性肝脏疾病：代谢性肝病通常是由于遗传性酶缺陷导致体内毒性代谢产物堆积，继而对机体产生毒性作用的一组先天性肝脏疾病。目前，临床上普通的治疗效果较差。但是，随着HSC研究的发展，这类疾病将会获得良好的治疗效果。克里格勒-纳贾尔综合征Ⅰ型鼠模型接受50Gy光照射然后再给予HSC移植，检验指标提示鼠克里格勒-纳贾尔综合征Ⅰ型已临床治愈［30］。

2.3.3 肝脏移植手术的辅助治疗：由于肝脏手术往往经历了缺血/再灌注损伤（IRI）及术后各种免疫损伤，严重影响了患者的生活质量及移植肝的长期存活率。鉴于BMSC的生物学特性，目前已将其应用于肝移植术后辅助治疗的临床研究中。2011年日本学者研究证实了BMSC通过抑制肝细胞凋亡和促进肝细胞再生来明显减轻大鼠IRI［38］。Ismail等［39］通过比较肝切除手术前接受与未接受自体HSC移植治疗的两组患者发现，术前接受HSC移植患者术后肝功能指标恢复明显优于后者，且未发生术后并发症。由此可见，肝移植联合干细胞移植可有效减轻IRI及排斥反应的发生，并可减少免疫抑制剂的使用。

3 问题与展望

HSC的研究虽然已经进入一个新的阶段，但由于自体BMSC移植开展时间不长，因此仍有大量的难题需要研究和解答，例如肝细胞在实际的分离纯化及特异性标志物鉴定过程中的进一步优化，在诱导分化成为成熟干细胞过程中各种细胞刺激因子及其他因素的调控作用机制，及HSC移植到活体肝脏中后各种微环境的具体作用机制等。同时，HSC移植途径、部位、移植细胞数量等移植标准及规范化也有待于建立。随着对HSC研究的不断深入，我们相信HSC移植治疗晚期肝病的应用前景会非常广阔，必将在各种肝脏疾病尤其是晚期肝病的治疗领域中开辟新的途径［24，40］。