活血降脂方对小鼠脂肪肝的防治作用*

胡巢凤，孙丽萍，周　晗，杨钦河，陆大祥△(暨南大学医学院病理生理学系，国家中医药管理局重点实验室，广东广州506;暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院肾内科，广东深圳5800;暨南大学医学院中医系，广东广州506)



活血降脂方对小鼠脂肪肝的防治作用*

胡巢凤1▲，孙丽萍2▲，周晗1，杨钦河3，陆大祥1△
(1暨南大学医学院病理生理学系，国家中医药管理局重点实验室，广东广州510632;2暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院肾内科，广东深圳518020;3暨南大学医学院中医系，广东广州510632)

［摘要］目的:探讨活血降脂方对小鼠脂肪肝的防治作用及机制。方法:高脂饲料喂养小鼠，分别用不同剂量的活血降脂方(由人参、三七、天麻组成，命名为GST)给小鼠灌胃2周，检测血脂、肝组织甘油三酯(TG)含量，并观察肝指数和肝脏病理变化，筛选出药物的最佳用药剂量。此外，小鼠分为正常对照(NC)组，喂基础饲料;模型组喂高脂饲料。12周后将模型小鼠随机分为高脂(HF)组，正常饮食(ND )组和GST组。除HF组饲高脂饲料外，其余各组饲基础饲料; GST组给予GST灌胃2周，其余各组以同等容积蒸馏水灌胃。检测血清总胆固醇(TC)、TG、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及肝组织TC、TG含量，观察肝指数、肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量，肝组织病理变化及过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、细胞色素P450 2E1(CYP2E1)的mRNA表达。结果: GST可显著降低血脂、肝脂和MDA水平，增加SOD活性，明显降低肝指数并改善肝组织脂肪变性，增加肝组织PPARα mRNA表达、抑制CYP2E1 mRNA的表达。结论: GST具有有效防治脂肪肝的作用，其机制可能与上调肝组织PPARα mRNA的表达、降低血清和肝组织TG含量、下调CYP2E1 mRNA的表达以及抗脂质过氧化反应有关。

［关键词］脂肪肝;活血降脂方;甘油三酯;脂质过氧化反应

［修回日期］2015-05-15

▲并列第1作者

Role of Huoxue Jiangzhi Recipe in preventing and treating fatty liver in mice

HU Chao-feng1，SUN Li-ping2，ZHOU Han1，YANG Qin-he3，LU Da-xiang1
(1Department of Pathophysiology，Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China;2Department of Nephrology，Shenzhen People’s Hospital，Second Clinical Medical College of Jinan University，Shenzhen 518020，China;3Department of traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510632，China.E-mail: ldx@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To explore the role of Huoxue Jiangzhi Recipe in preventing and treating fatty liver in mice and its underlying mechanisms.METHODS: Healthy Kunming mice were fed with high-fat diet and treated intragastrically with different doses of Huoxue Jiangzhi Recipe (compound of ginseng，panax notoginseng and rhizoma gastrodiae，named as GST) for 2 weeks.The levels of blood lipids and triglyceride (TG) in hepatic tissues were measured.Meanwhile，liver index and hepatic pathology were observed.The optimized dosage of Huoxue Jiangzhi Recipe was determined by the experiments.The mice were divided into normal control group (NC group，fed with normal diet) and model group (fed with highfat diet).The model mice were subdivided into 3 subgroups 12 weeks later: HF group (fed continuously with high-fat diet)，ND group (fed with normal diet)，GSL group (fed with normal diet and treated intragastrically with GSL).The mice in NC，HF and ND groups were given distilled water by gastric perfusion.Two weeks later，all mice were killed，and blood was collected for measuring serum total cholesterol (TC)，TG，high-density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)，low-density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) contents，hepatic TC，TG，malondialdehyde (MDA) levels and superoxide dismutase (SOD) activity were detected.Moreover，liver index and hepatic pathology were also observed.The mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARα) and cytochrome-P450 2E1 (CYP2E1) in the liver was examined by RT-PCR.RESULTS: GST significantly decreased serum lipid，hepatic lipid and MDA levels and elevated SOD activi-ty.Furthermore，GST markedly reduced liver index，improved hepatic adipose infiltration，increased PPARα mRNA expression and inhibited CYP2E1 mRNA expression.CONCLUSION: GST is effective in the treatment of fatty liver in mice by up-regulating PPARα，thus reducing serum and hepatic TG levels，down-regulating CYP2E1 and inhibiting lipid peroxidation.

［KEY WORDS］Fatty liver; Huoxue Jiangzhi recipe; Triglyceride; Lipid peroxidation

脂肪肝是由一种或者多种原因引发的以肝脏脂类物质，主要是甘油三酯(triglyceride，TG)蓄积为病变特征的肝脏疾病。随着生活习惯和饮食结构的改变，检测手段的进步，脂肪肝的发病率和检出率日渐增多，发病年龄呈现年轻化趋势。并且脂肪肝可在较短期内发展为不可逆的肝损害［1］。

西医治疗学方面迄今为止，临床上尚无满意治疗脂肪肝的药物。近年来有关运用中医药治疗脂肪肝的报道逐渐增多，众多学者均认为脂肪肝是肝失疏泄、脾失健运、湿热内蕴、痰浊郁结、瘀血阻滞而最终形成湿痰瘀阻互结，痹阻肝脏脉络而形成脂肪肝。基于目前的研究趋势，寻找更有效治疗脂肪肝的中药，并探讨其具体作用靶点及作用机制是一项十分有意义和有应用前景的研究。根据中药理论，我们自拟了具有活血降脂的中药复方(由人参、三七、天麻组成，命名为GST)，并采用小鼠高脂性脂肪肝模型，探讨该中药复方治疗脂肪肝的作用和机制，为临床寻找有效防治脂肪肝的药物提供实验依据。

材料和方法

1实验动物

1.1实验动物健康昆明小鼠101只，SPF级，雄性，体重18～22 g，由广东省实验动物中心提供。

1.2材料人参、三七、天麻的中药免煎颗粒剂购自三九医药股份有限公司;胆酸钠(杭州微生物试剂有限公司) ;胆固醇(国药集团化学试剂有限公司) ;丙硫氧嘧啶(广东华南药业有限公司) ;猪油(广州市加益食品有限公司) ;异丙醇(天津市化学试剂一厂) ;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成生物公司; Trizol(Invitrogen) ; dNTP和Oligo(TaKaRa) ; Taq酶(上海申能博彩公司) ; RNAsin和M-MLV逆转录酶(Promega)。

2中药GST防治小鼠脂肪肝最佳剂量的筛选

2.1高脂饲料配制用2%胆固醇、10%猪油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠配制，其余为基础饲料。

2.2实验分组将中药免煎颗粒剂溶于双蒸水，配成高剂量(人参、三七、天麻终浓度均为130 g/L)、中剂量(人参、三七、天麻终浓度均为65 g/L)及低剂量(人参、三七、天麻终浓度均为32.5 g/L) 3种浓度的中药GST溶液。将50只小鼠随机分为5组，(1)正常对照(normal control，NC)组:喂基础饲料，每天用蒸馏水灌胃(0.1 mL/10 g) ; (2)高脂(high-fat diet，HF)组:喂高脂饲料，每天用蒸馏水灌胃(0.1 mL/10 g) ; (3) GST低剂量(low-dose)组:喂高脂饲料，每天用低剂量GST溶液灌胃; (4) GST中剂量(mediandose)组:喂高脂饲料，每天用中剂量GST溶液灌胃; (5) GST高剂量(high-dose)组:喂高脂饲料，每天用高剂量GST溶液灌胃，中药组灌胃量均为0.1 mL/10 g;各组连续处理2周。实验结束后，所有动物禁食12 h，称体重，摘眼球取血，用于测血脂含量。取血后迅速剖腹，将完整的肝脏取出，滤纸吸干表面水分后称重。

2.3观察指标及测定方法(1)肝指数:称肝重，肝指数=肝湿重/体重×100%; (2)血脂测定:全自动生化分析仪测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)含量; (3)肝脂测定:取肝组织100 mg，按1∶9加异丙醇，在冰水中制成10%匀浆，提取上清液，全自动生化分析仪测定TG、TC含量; (4)肝组织形态学观察:分别从对照组和高脂组肝左、中、右叶相同部位各取1块肝组织进行HE染色。

3中药GST对小鼠脂肪肝的治疗作用

3.1模型建立及实验分组51只小鼠，实验前小鼠自由饮水进食，在实验环境中适应6 d，随机分为2组，NC组12只，喂基础饲料;模型组39只，喂高脂饲料。12周后将39只模型小鼠随机分为3组:高脂(high-fat diet，HF)组12只;正常饮食(normal diet，ND)组13只;中药GST组14只;用GST中剂量，按0.1 mL/10 g体重灌胃，其余各组以同等容积蒸馏水灌胃。高脂组继续喂高脂饲料，其余各组均喂基础饲料饲养，连续2周。实验结束后，所有动物禁食12 h，称体重，摘眼球取血。取血后迅速剖腹，将完整的肝脏取出，滤纸吸干表面水分后称重。

3.2 SOD活性、MDA含量的测定称取适量肝组织，加生理盐水，在冰水中制成10%匀浆，提取上清液，按试剂盒说明检测SOD活性及MDA水平;考马斯亮蓝法测肝组织蛋白含量。

3.3细胞色素P450 2E1 (cytochrome-P450 2E1，CYP2E1)及过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα) mRNA表达检测取适量肝组织，加入TRIzol裂解液，提取总RNA。引物由上海生物工程公司合成，CYP2E1 及PPARα引物序列见表1。PCR反应条件为: 95℃2 min; 94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，30个循环; 72℃10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，用全自动凝胶数码成像及分析仪进行分析，计算CYP2E1、PPARα mRNA与GAPDH mRNA条带的相对吸光度(A)值。

表1　引物序列Table 1.Sequences of the primers

4统计学处理

使用SPSS 13.0对实验数据进行分析和处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 GST对小鼠脂肪肝的防治作用及最佳剂量的筛选

1.1不同剂量GST对小鼠血脂的影响如表2所示，小鼠喂高脂饲料2周，HF组血清TC、HDL-C、LDL-C含量及TC/HDL-C较NC组明显升高，虽然HDL-C含量增加，但TC/HDL-C比值也明显升高，而TG含量与NC组比较无显著差异;上述血脂改变符合小鼠饮食性高脂血症的特点，属于Ⅱa型高脂血症。GST中剂量及高剂量组能显著降低血清TG含量;但血清TC、HDL-C、LDL-C含量及TC/HDL-C比值与HF组比较差异均无统计学意义; GST低剂量组血脂各项指标与HF组比较无显著差异。

表2　 GST对高脂饮食小鼠血脂的影响Table 2.The effect of GST on serum lipid in mice fed with high-fat diet (Mean±SD.n=10)

表3　 GST对高脂饮食小鼠肝指数及肝组织TC和TG水平的影响Table 3.The effect of GST on liver index and levels of hepatic TC and TG in mice fed with high-fat diet (Mean±SD.n=10)

1.2不同剂量GST对小鼠肝指数及肝脂水平的影响结果如表3所示，与NC组比较，HF组肝指数及TC、TG水平明显升高;而GST中剂量及高剂量组肝指数明显低于高脂组; GST低剂量组肝指数与HF组无显著差异。HF组肝组织TC及TC水平显著高于NC组;而GST中剂量及高剂量组肝组织TG水平明显低于HF组; GST低剂量组肝组织TG水平与HF组无显著差异;各用药组肝组织TG水平与HF组比较差异无统计学意义。

1.3小鼠肝组织病理变化NC组肝细胞排列整齐; HF组出现明显的肝细胞脂肪变性，以小泡性脂肪变性为主; GST低剂量组也出现明显的肝细胞脂肪变性，与HF组病理改变相似; GST中剂量及高剂量组肝细胞排列较整齐，肝小叶比较清晰，仅见散在脂肪变性，脂肪变性比高脂组明显减轻，见图1。以上实验结果显示，GST中剂量是防治小鼠脂肪肝的最佳剂量。

Figure 1.The pathological changes of hepatic tissues in mice with different treatments (HE staining，×400).A: NC; B: HF; C: GST (low-dose) ; D: GST (median-dose) ; E: GST (high-dose).图1各组小鼠肝组织病理变化

2 GST对小鼠脂肪肝的治疗作用及机制研究

2.1各组小鼠肝组织病理改变NC组肝细胞排列整齐; HF组出现明显的肝细胞脂肪变性，部分肝细胞坏死，细胞核固缩，并有炎症细胞浸润;由于脂肪肝有自愈现象，本研究在高脂喂养小鼠12周建立脂肪肝模型后，给予小鼠正常饮食，ND组肝细胞出现大泡性脂肪变性，与HF组比较肝细胞脂肪变性程度减轻; GST组与HF和ND组比较，肝细胞脂滴减少，脂肪变性明显改善，见图2。

Figure 2.The pathological changes of hepatic tissues in mice with different treatments (HE staining，×400 ).图2各组小鼠肝组织病理变化

2.2各组小鼠血脂含量的比较HF组血清TC、HDL-C、LDL-C含量及TC/HDL-C较NC组明显升高，而TG含量与NC组比较无显著差异; ND组血清TC含量及TC/HDL-C显著高于NC组，HDL-C、 LDL-C及TG含量恢复至NC组水平; GST组能明显降低血清TG含量，而其余各项指标与ND组比较无显著差异，见表4。

表4　 GST对小鼠血脂含量的影响Table 4.The effect of GST on serum lipid levels in mice(Mean±SD)

2.3各组小鼠肝指数、肝脂、SOD活性和MDA水平的比较结果如表5所示，与NC组比较，HF组肝指数及TC、TG水平明显高于NC组; ND组肝指数及TC、TG水平也显著高于NC组，但低于HF组; GST组与HF组和ND组比较，其肝指数和TG含量均明显降低;而TC水平则无显著差异。HF组肝组织SOD活性显著低于NC组，MDA含量明显高于NC 组; ND组SOD活性也显著低于NC组，却明显高于HF组;而MDA含量高于NC组，但低于HF组; GST组与HF组和ND组比较，SOD活性显著上升，MDA含量明显下降。

表5　各组肝指数、肝脂、SOD活性和MDA水平的比较Table 5.Comparison of liver index，hepatic lipid，SOD activity and MDA level among different groups (Mean±SD)

2.4小鼠肝组织CYP2E1和PPARα mRNA的表达

与NC组比较，HF组肝组织CYP2E1的mRNA表达明显升高; ND组肝组织CYP2E1的mRNA水平也高于NC组，但低于HF组; GST组与ND和HF组比较，肝组织CYP2E1的mRNA表达显著降低。与NC组比较，HF组肝组织PPARα的mRNA表达明显降低; ND组肝组织PPARα mRNA水平也低于NC组，但明显高于HF组; GST组与ND和HF组比较，肝组织PPARα的mRNA表达显著升高，见图3。

Figure 3.The mRNA expression of CYP2E1 (A) and PPARα(B) in hepatic tissues of mice among different groups.Mean±SD.n=12～14.＊＊P＜0.01 vs NC group;△△P＜0.01 vs HF group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ND group.图3各组小鼠肝组织CYP2E1和PPARα mRNA的表达

讨论

高脂血症是导致脂肪肝的重要因素之一，高脂血症性脂肪肝形成主要由于进食脂肪过多或各种原因引起脂肪代谢障碍，导致脂肪在肝细胞内积聚而成［2］。目前脂肪肝的发生机制尚未彻底明确，西医治疗以降脂、护肝药为主，由于许多降脂化学药有损害肝脏的副作用，因而在脂肪肝的临床治疗中受到限制。中医药在对脂肪肝的临床和实验研究方面已取得长足的进步，寻找更有效的脂肪肝治疗中药，并探讨其具体作用靶点及作用机制是一项十分有意义和有应用前景的研究。

人参为补益药，主要功能是大补元气，滋补强壮，补脾益肺，生津安神，具有增强机体抵抗力、提高机体免疫力、抗氧自由基、降血糖和血脂等作用［3］。三七有活血化瘀，行气止痛之功，并扩张血管、降低血压、降血脂、抗氧化、改善肝脏微循环、护肝等作用［4］。天麻能“主诸风痹，久服益气，轻身长年”，中医临床用于治疗惊风抽搐、风湿痹、头痛、眩晕、胸痹、癫痫等病。有研究报道天麻具有抗氧化、抗炎作用［5］。三药合用具有扶正固本、生津安神、消淤去脂之功效。

本实验采用高脂饲料饲养小鼠，建立小鼠高脂血症和脂肪肝模型(高脂饲养2周)，HF组小鼠血清TC、LDL-C显著升高，但血清TG含量与NC组比较无显著差异［6］，属于Ⅱa型高脂血症。实验中我们观察了中药GST对小鼠脂肪肝的防治作用，并研究了GST的剂量-效应关系。结果发现，HF组血脂、肝脂、肝指数显著高于NC组，肝细胞出现明显的脂肪变性; GST中剂量及高剂量组可降低血清TG的含量，并降低肝组织TG含量，抑制肝指数升高，减轻肝细胞脂肪变性，具有防治脂肪肝的作用; GST低剂量组对脂肪肝无明显改善作用; GST中剂量及高剂量组对脂肪肝的防治效果比较明显，尤其是GST中剂量组效果较好，因此在中药GST对小鼠脂肪肝的治疗作用研究中我们采用GST中剂量。

本研究建立小鼠高脂性脂肪肝模型(高脂饲养12周)，发现HF组小鼠肝指数、肝组织TC、TG含量明显升高，肝细胞脂肪变性程度严重; ND组肝指数、肝组织TC、TG含量虽然低于HF组，但仍维持在较高的水平。GST组肝指数、肝组织TG水平均较ND组显著下降，肝病理切片显示脂肪变性明显改善。结果表明，小鼠长期饲以高脂饲料可导致脂肪肝，恢复正常饲料喂养后，脂肪肝有一定的自然恢复，但效果不如治疗组。GST可显著降低肝组织TG水平，有效改善脂肪肝变性程度，但对肝组织TC合成影响不明显。

高脂饮食可导致游离脂肪酸摄入增多和利用减少。游离脂肪酸能够加强脂质过氧化反应，损伤肝细胞，其产物MDA等可使细胞膜的流动性发生障碍，引起细胞功能障碍甚至细胞死亡［7］。在造成肝损伤的同时又进一步引起自由基的释放，形成恶性循环。本实验中HF组肝组织SOD活性明显低于对照组，而MDA含量则显著高于NC组，提示HF组氧化应激反应增强。反应产物MDA增多，而抗氧化能力却下降。ND组SOD活性也低于NC组，却较HF组升高，MDA含量高于NC组，但低于高脂组，说明恢复正常饮食后脂质过氧化反应有一定的减弱。GST组与HF组和ND组比较，SOD活性显著上升，MDA含量明显下降，提示中药GST能明显抑制过氧化反应，提高机体清除氧自由基的能力。

在非酒精性脂肪肝，患者长期摄入高脂饮食，外源性脂肪吸收增加，肝脏摄取脂肪酸及其酯化作用增强，TG合成超过其运转，从而在肝内沉积，使线粒体β氧化速度代偿性增加，为脂质过氧化提供了足够的反应基质，产生了大量活性氧;并且高脂饮食能增加CYP2E1活性，CYP2E1使肝组织产生氧自由基引起脂质过氧化损伤［8-9］;脂质过氧化反应干扰了肝内脂类代谢，而脂质沉积的增多又加重了过氧化反应［10］。本研究证实，HF组肝组织CYP2E1的mRNA表达明显高于NC组; ND组具有一定抑制CYP2E1mRNA表达的作用; GST可显著降低肝组织CYP2E1的mRNA表达，从而抑制脂质过氧化反应，保护肝细胞。

PPARα的活化可诱导肝脂蛋白脂肪酶及载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ的表达，从而催化脂蛋白中的TG分解为游离脂肪酸以及增加TC的逆向转运。因此，PPARα是调节能量代谢的关键因素，在维持体内脂质代谢的动态平衡中起枢纽作用。研究表明，PPARα缺乏可以引起肝脏TG沉积、脂类和碳水化合物代谢紊乱［8］。因此，PPARα表达受抑可使脂肪酸在肝脏氧化减少，脂蛋白合成代谢发生障碍，导致脂质在肝脏沉积，从而加速脂肪肝的发生发展。本实验发现，HF组肝组织PPARα的mRNA表达明显低于NC组;而ND组能一定程度上增加PPARα的mRNA水平; GST能增强PPARα的mRNA表达，发挥其调控脂质代谢的作用，抑制肝脏脂质沉积。

综上所述，中药GST具有有效防治脂肪肝的作用，其机制可能与下调CYP2E1的mRNA表达，抑制氧化应激反应;并且增加肝组织PPARα的mRNA表达，发挥防治脂肪肝的作用。

［参考文献］

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通讯作者△Tel: 020-85228071; E-mail: ldx@ jnu.edu.cn

*［基金项目］广东省自然科学基金资助项目(No.S201201000816)

［收稿日期］2015-01-07

［文章编号］1000-4718(2015)06-1087-06

［中图分类号］R289.51; R363.2

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.021