微囊介导VE-Cad胞吞参与了LPS作用后血管通透性增高的形成*

张　晔，张连阳，孙士锦，李　阳，谭　浩(第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆400042)



微囊介导VE-Cad胞吞参与了LPS作用后血管通透性增高的形成*

张晔，张连阳△，孙士锦，李阳，谭浩
(第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆400042)

［摘要］目的:观察脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作用后微囊介导的血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-Cad)胞吞，及其在血管通透性增高中的作用。方法:采用人血管内皮细胞株CRL-2922，以及免疫组化、免疫印迹、免疫共沉淀等技术方法，观察LPS处理后不同时点细胞质膜微囊重要结构蛋白小窝蛋白1 (caveolin-1，Cav1)的蛋白表达和磷酸化，Cav1与VE-Cad的共沉淀和共定位，以及微囊抑制剂对LPS处理后Cav1 与VE-Cad的共沉淀、VE-Cad质膜表达和单层细胞通透性的影响。结果: (1) LPS处理后Cav1蛋白表达无显著变化，但其Tyr14位点的磷酸化水平逐渐增高(P＜0.05)，Cav1与VE-Cad的免疫共沉淀逐渐增多(P＜0.05)，免疫组化激光共聚焦显微镜观察在4 h时可见明显的共定位; (2)细胞质膜微囊抑制剂非律平(5 mg/L)可以显著减少LPS处理4 h Cav1与VE-Cad的免疫共沉淀(P＜0.05)，增强VE-Cad的质膜表达(P＜0.05)，改善单层细胞通透性(P＜0.05)。结论:细胞质膜微囊介导VE-Cad胞吞参与了LPS作用后血管通透性增高的形成。

［关键词］血管通透性增高;脂多糖;血管内皮钙黏蛋白;细胞质膜微囊;小窝蛋白1

［修回日期］2015-03-23

Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad contributes to vascular hyperpermeability after LPS treatment

ZHANG Ye，ZHANG Lian-yang，SUN Shi-jin，LI Yang，TAN Hao
(State Key Laboratory of Trauma，Burns and Combined Injury，Trauma Center of PLA，Institute of Surgery Research，Daping Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400042，China.E-mail: hpzhangly@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe caveolae-mediated endocytosis of vascular endothelial cadherin (VE-Cad) after lipopolysaccharide (LPS) treatment，and its role in vascular hyperpermeability.METHODS: Human vascular endothelial cell line CRL-2922 was used in the experiment.Western blot，co-immunoprecipitation and immunocytochemistry were adopted to observe the protein expression of caveolin-1 (Cav1)，a main structural protein of caveolae，after LPS treatment.Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad after LPS treatment，and the effects of caveolae inhibitor on caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad，the protein expression of VE-Cad and monolayer cell permeability after LPS treatment were determined.RESULTS: After LPS treatment，the protein expression of Cav1 did not show a significant change，while the phosphorylation (Tyr14) of Cav1 was significantly increased (P＜0.05).No co-immunoprecipitation or co-localization of VECad with Cav1 was observed in the normal control，and that was increased time-dependently after LPS treatment (P＜0.05).Filipin，an inhibitor of caveolae，at concentration of 5 mg/L significantly reduced the co-immunoprecipitation of VE-Cad with Cav1 (P＜0.05)，increased the expression of VE-Cad (P＜0.05) in the membrane，and improved the monolayer cell permeability at 4 h after LPS treatment (P＜0.05).CONCLUSION: Caveolae-mediated endocytosis of VECad contributes to the internalization of VE-Cad and the monolayer cell hyperpermeability after LPS treatment.

［KEY WORDS］Vascular hyperpermeability; Lipopolysaccharides; Vascular endothelial cadherin; Caveolae; Caveolin-1

血管通透性增高是严重创伤、脓毒症患者的重要病理改变，表现为血管内皮屏障受损、对液体、血浆蛋白、大分子物质的通透性增高，导致组织水肿，促进内环境紊乱等合并症发生。脂多糖(lipopolysac-charide，LPS)是脓毒症的重要启动因子，研究阐明LPS诱导血管通透性增高的发生机制有重要意义。

黏附连接是血管内皮细胞间(除血脑屏障外)的主要连接方式，黏附连接的重要结构蛋白血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-Cad)被胞吞，可以引起黏附连接强度降低、细胞间隙开放和血管通透性增高［1-2］。以往研究认为VE-Cad的胞吞主要受网格蛋白介导［3］，但LPS作用后，网格蛋白重链表达下调，导致网格蛋白介导的胞吞功能减弱［4］。近来有研究发现，在肿瘤上皮细胞中，细胞质膜微囊(简称微囊)还可以胞吞黏附连接的重要结构蛋白上皮钙粘蛋白(epithelial cadherin，E-Cad)，引起连接破坏、细胞分离和肿瘤转移。

试想，在血管内皮细胞中，如果存在LPS作用下微囊介导的VE-Cad胞吞，势必引起黏附连接破坏和细胞间隙形成，从而可以解释LPS诱导血管通透性增高的形成。然而迄今尚未见文献报道。因此，本研究拟采用人血管内皮细胞株CRL-2922，以及免疫组化、免疫印迹、免疫共沉淀等技术方法，观察LPS作用后微囊介导的VE-Cad胞吞，及其在血管通透性增高中的作用。

材料和方法

1细胞培养和接种方式

采用人血管内皮细胞株CRL-2922(ATCC)，在含15%胎牛血清(Gibco)、4.5 g/L葡萄糖、4 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(HyClone)中进行培养，当细胞生长至融合时进行实验。用于免疫共沉淀和免疫印迹的细胞接种在25 mL培养瓶中，用于单层细胞通透性检测的细胞接种在培养小室(Corning)的半透膜上，用于免疫组化的细胞接种在盖玻片上。

2实验方法

2.1LPS处理后小窝蛋白1(caveolin-1，Cav1)与VE-Cad的共沉淀和共定位取生长至融合的细胞，实验分组为正常对照组、LPS处理1 h组、LPS处理2 h组、LPS处理4 h组及LPS处理6 h组。按照各组要求以LPS(Sigma) 10 mg/L处理并维持不同时间，检测Cav1蛋白表达和磷酸化，以及Cav1与VE-Cad的共沉淀和共定位。

蛋白及磷酸化检测时，先收集细胞总蛋白并定量，常规Western blot技术检测Cav1蛋白表达和磷酸化(Cav1抗体购自Santa Cruz; Cav1 Tyr14位点磷酸化抗体购自Cell Signaling)，洗膜后检测β-actin (Sigma)表达，Quantity One软件分析蛋白条带，以目标蛋白与β-actin吸光度值之比反映其表达或磷酸化水平。

免疫共沉淀观察时，在蛋白裂解液中分别加入VE-Cad抗体(Santa Cruz)和蛋白G-琼脂糖(Sigma) 4℃过夜，放射免疫沉淀分析缓冲液(Sigma)洗沉淀并煮沸分离后，常规Western blot技术检测Cav1表达，洗膜后检测VE-Cad表达，以Cav1/VE-Cad条带吸光度值之比反映两者的共沉淀。

共定位观察时，将细胞经过常规固定、透化和封闭处理，然后加入VE-Cad和Cav1抗体4℃过夜，PBS缓冲液洗涤后加入FITC-或罗丹明标记的Ⅱ抗(Invitrogen) 37℃孵育1 h，PBS缓冲液洗涤后采用Leica TCS-SP共聚焦显微镜观察荧光图像，以2种荧光的重叠反映两者的共定位。

2.2微囊抑制剂非律平(Santa Cruz)对LPS处理后Cav1与VE-Cad的共沉淀、VE-Cad质膜蛋白表达和单层细胞通透性的影响取生长至融合的CRL-2922细胞，实验分组为正常对照组、LPS处理4 h组、微囊抑制剂非律平+ LPS处理4 h组，所用非律平浓度为5 mg/L，并按实验组要求以LPS(10 mg/L)处理4 h，检测Cav1与VE-Cad的共沉淀、VE-Cad质膜表达和单层细胞通透性。

收集细胞检测VE-Cad质膜表达，采用质膜蛋白提取试剂盒(Abcam)提取胞浆和质膜蛋白，常规Western blot技术检测质膜蛋白中VE-Cad(1∶200)表达，胞浆蛋白中检测β-actin表达，以质膜VE-Cad与β-actin吸光度值之比反映其表达水平。

取细胞生长融合的培养小室检测单层细胞通透性，按照实验组要求进行处理完毕后，在培养小室的上腔液中加入异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白(FITC-BSA)作为示踪剂(Sigma)，在下腔液中取样，间隔15 min取样1次，共累计2 h，检测下腔液样品的荧光强度，计算累计荧光透过率反映单层细胞通透性。

3统计学处理

所有数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 10.0统计软件进行分析，组内自身对照和配对实验数据用t检验，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 LPS处理后不同时点的Cav1蛋白表达和磷酸化变化

LPS处理后，微囊主要的蛋白成分Cav1的蛋白表达无显著变化，但其Tyr14位点磷酸化水平却逐渐增高(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.The protein expression and phosphorylation (Tyr14) of Cav1 after LPS treatment.Mean±SD.n=4.#P＜0.05 vs control group.图1 LPS处理后不同时点的Cav1蛋白表达和磷酸化

2 LPS处理后的Cav1与VE-Cad的共沉淀和共定位

Cav1与VE-Cad的免疫共沉淀在正常对照组中几乎未见，随着LPS处理时间延长而逐渐增多(P＜0.05)。免疫组化激光共聚焦显微镜观察其共定位也发现在4 h有明显的共定位，见图2。

3微囊抑制剂对LPS处理后Cav1与VE-Cad的共沉淀、VE-Cad质膜蛋白表达和单层细胞通透性的影响

微囊抑制剂非律平(5 mg/L)可以显著减少LPS处理4 h时Cav1与VE-Cad的免疫共沉淀(P＜0.05)，增强VE-Cad的质膜表达(P＜0.05)，改善单层细胞通透性，使荧光通透率从4 h的70.4%降低至44.9%(P＜0.05)，见图3。

讨论

微囊又称外胞浆膜泡，是细胞膜表面直径约50～100 nm的细颈瓶样膜结构。在内皮细胞中密度尤其高，占细胞体积的20%，Cav1是非肌性细胞中微囊发挥重要生理功能所必须的结构蛋白［5］。微囊最基本的功能是胞吞转运，可胞吞白蛋白并转运至细胞对侧，是生理情况下白蛋白等大分子物质进出毛细血管的主要通道。

Figure 2.Co-immunoprecipitation and co-localization of VE-Cad with Cav1 after LPS treatment.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control group.图2 LPS处理后的Cav1与VE-Cad的共沉淀和共定位

以往研究发现，微囊可以在人表皮样癌细胞以及胰腺导管癌上皮细胞，胞吞上皮细胞间黏附连接的重要结构蛋白E-Cad，引起连接破坏、细胞分离和肿瘤转移［6-7］。但是否能胞吞VE-Cad从而调节血管通透性尚不清楚。仅有相关文献发现，用不同浓度(0.05～0.8 mmol/L)的过氧化氢作用于小鼠肺血管内皮细胞，可导致Cav1的第14位酪氨酸(Tyr14)磷酸化水平增高2～9倍，作用后30 min达到最高，同时伴随着黏附连接复合物VE-Cad/β-catenin分离、细胞间黏附连接破坏［8］，提示微囊胞吞与VE-Cad解离、黏附连接破坏具有某种关联。

Figure 3.The effects of caveolae inhibitor on caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad，the protein expression of VE-Cad and monolayer cell permeability after LPS treatment.Mean±SD.n=3～6.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs LPS 4 h group.图3微囊抑制剂对LPS处理后Cav1与VE-Cad的共沉淀、VE-Cad质膜蛋白表达和单层细胞通透性的影响

我们采用细胞免疫组化和免疫共沉淀等技术，发现LPS处理后Cav1与VE-Cad的免疫共沉淀逐渐增多，免疫组化激光共聚焦显微镜观察也发现在4 h有明显的共定位;微囊抑制剂非律平可以显著减少LPS处理4 h时Cav1与VE-Cad的免疫共沉淀，增强VE-Cad的质膜表达，改善单层细胞通透性。提示微囊介导VE-Cad胞吞参与了LPS作用后血管通透性增高的形成。

LPS引起血管通透性增高主要有2条途径，一是“细胞间”途径，通过刺激炎症介质和细胞因子释放，使内皮细胞张力丝形成并收缩，导致细胞间黏附连接破坏、细胞间隙增大、血管通透性增高［9］;二是“跨细胞”途径:通过微囊对大分子物质的直接胞吞，导致血管通透性增高［10］。“细胞间”途径开放是血管通透性增高的主要原因［11］。我们的研究发现，尽管如此，“跨细胞”途径的微囊可以通过胞吞“细胞间”途径的重要门控分子VE-Cad，开放“细胞间”途径，促进血管通透性增高的形成，提示“跨细胞”途径和“细胞间”途径之间存在交互作用，从而补充了对这两条途径功能的认识。

我们的研究还发现，在LPS作用后微囊胞吞VE-Cad的过程中，Cav1的表达无明显变化，但磷酸化程度显著增高。以往的文献也发现微囊的胞吞功能取决于Cav1的磷酸化程度，在肺微血管内皮细胞，利用基因技术使Cav1的磷酸化位点突变，可阻断激动剂引起的微囊对白蛋白和霍乱毒素B的胞吞作用［12］，那么LPS作用后通过怎样的信号途径磷酸化Cav1，以调节微囊的胞吞功能和血管通透性，尚待进一步研究。

［参考文献］

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通讯作者△Tel: 023-68757991; E-mail: hpzhangly@163.com

*［基金项目］“十二五”国家科技支撑计划(No.2012BAI11B01) ;军队“十二五”重点项目(No.BWS12J033)

［收稿日期］2014-12-10

［文章编号］1000-4718(2015)06-1070-05

［中图分类号］R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.018