加减一阴煎改善去势大鼠内皮功能紊乱*

徐静婷，曹娅麟，郑文晖，张亚星，王　玲，王庭槐(中山大学中山医学院生理教研室，广东广州510080)



加减一阴煎改善去势大鼠内皮功能紊乱*

徐静婷，曹娅麟，郑文晖，张亚星，王玲，王庭槐△
(中山大学中山医学院生理教研室，广东广州510080)

［摘要］目的:探讨加减一阴煎对去势大鼠内皮功能紊乱的影响。方法:采用血管张力仪测定SD大鼠内皮依赖性舒张功能，扫描电镜观察胸主动脉内皮细胞形态，Western blotting技术检测内皮脂肪酶的表达，HE染色观察大鼠子宫内膜的形态。结果:加减一阴煎逆转了去势大鼠内皮依赖性舒张功能的降低;加减一阴煎减少了去势大鼠内皮细胞脂质的堆积，降低了去势大鼠内皮脂肪酶的表达水平;加减一阴煎对去势大鼠子宫湿重的影响不大。结论:加减一阴煎可改善去势大鼠血管内皮依赖性舒张功能，维持内皮细胞形态的完整。

［关键词］加减一阴煎;戊酸雌二醇;内皮依赖性舒张;内皮脂肪酶

［修回日期］2015-04-24

Effect of Jia-jian-yi-yin decoction on endothelial dysfunction in ovariectomized female rats

XU Jing-ting，CAO Ya-lin，ZHENG Wen-hui，ZHANG Ya-xing，WANG Ling，WANG Ting-huai
(Department of Physiology，Zhongshan School of Medicine，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail: wangth@ mail.sysu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of Jia-jian-yi-yin decoction on endothelium-dysfunction in ovariectomized rats.METHODS: The ovariectomized rats were treated with Jia-jian-yi-yin decoction or turbid liquid of estradiol valerate for 8 weeks.The vascular ring tension was measured.Scanning electron microscopy and Western blotting were applied to assess the function of endothelium-dependent dilation，aortic endothelial morphology and the expression of endothelial lipase.The pathologic sections were prepared to observe the effect of Jia-jian-yi-yin decoction on the uterus.RESULTS: In ovariectomized rats，the decrease in endothelium-dependent relaxation to acetylcholine (ACh) was reversed to normal level，the endothelial morphology returned to normal without lipid accumulation and the endothelial lipase expression was decreased by Jia-jian-yi-yin decoction.Furthermore，no obvious change of the wet weight of uterine between the ovariectomized rats with or without Jia-jian-yi-yin decoction treatment was observed.CONCLUSION: Jia-jian-yi-yin decoction may have protective effects on endothelium-dependent vasodilation and aortic endothelial morphology in estrogen-deficient animals.

［KEY WORDS］Jia-jian-yi-yin decoction; Estradiol valerate; Endothelium-dependent dilation; Endothelial lipase

动脉粥样硬化是严重威胁人类健康的心血管疾病之一［1］。绝经期妇女动脉粥样硬化疾病的发病率显著升高，内皮功能紊乱是动脉粥样硬化的始动环节［2］，因此，维持内皮细胞的正常功能或及时逆转内皮功能紊乱为防治动脉粥样硬化的有效措施。雌激素(estrodiol，E2)具有心血管保护作用，然而，绝经后妇女长期补充雌激素可增加癌症发生风险，因此人们将目光投向具有拟雌激素样作用且副作用较少的植物雌激素。

加减一阴煎可追溯到明代(公元1642年)由张景岳所著的《景岳全书》，主要功效为滋阴清热［3］。现代知名老中医王飞翔先生在多年的临床实践中，将加减一阴煎用于治疗女子月经不调且疗效显著。加减一阴煎由11味中药经水煎而成，我室前期细胞实验结果表明加减一阴煎具有拟雌激素样作用，可促进血管内皮细胞的增殖及一氧化氮的释放从而发挥血管保护作用［4］，而加减一阴煎于在体实验中对血管内皮细胞的作用尚不清楚，因此本实验旨在观察加减一阴煎对去势大鼠内皮功能紊乱及内皮细胞形态的影响。

材料和方法

1材料

1.1中药组分熟地、地骨皮、生地、知母、麦门冬、丹参、川芎、黄精、牛膝、芍药和甘草购自中山大学附属第一医院中药房。

1.2动物8月龄SD雌性大鼠40只，重(340± 10) g，购自广东省实验动物中心，合格证号为SCXK(粤) 2011-0029。

1.3主要仪器Myodap血管环张力仪购自Danish Myo Technology A/S;扫描电子显微镜QUANTA200购自FEI; Western blotting凝胶成像系统购自Bio-Rad。

1.4主要试剂乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)和硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)购自Sigma;苯肾上腺素(phenylephrine，PE)购自上海禾丰药业有限公司;戊酸雌二醇购自仙灵药业有限公司;内皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)抗体购自Santa Cruz。SDS配胶试剂购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司; Western blotting发光液购自普莱利生物技术有限公司。

2主要方法

2.1加减一阴煎的制备将熟地、地骨皮、生地、知母、黄精、牛膝、芍药、甘草等11味中药用清水浸泡0.5 h后微火熬制1 h即可。之后将2煎中药分别熬制2次后的水煎液冻干称重，得出成人每日用量的平均值为37.55 g。根据大鼠与人体表面积折算的等效剂量为0.018的比值换算，得出大鼠每日的给药量为3.38 g/kg。

2.2卵巢摘除大鼠模型的制备10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，术野剪毛、消毒、铺巾，经腹背部肋缘下1 cm，脊柱两侧各1 cm交界处，分别切2个1 cm左右的切口，钝性分离肌肉，剪开腹膜，于腹腔脂肪中找到菜花样卵巢结扎并切除双侧卵巢，对照组不作任何处理，术后腹腔注射青霉素3 d预防感染。术后1周行阴道涂片检查，以不出现角化上皮细胞为造模成功。

2.3给药方式将大鼠随机分为正常对照组(MC)、去势组(MO)、加减一阴煎组(MY)和戊酸雌二醇组(ME)。动物模型制备成功后，将加减一阴煎冻干粉和碾成粉末的戊酸雌二醇分别溶于3 mL双蒸水中，给予处理组大鼠每日以中药3.38 g/kg或戊酸雌二醇1.2 mg/kg的剂量连续灌胃2个月［5］。对照组给予3 mL的双蒸水灌胃，去势组不做任何处理。之后处死大鼠，取血清和胸主动脉保存备用。

2.4血管环张力的测定大鼠麻醉后，打开胸腔并迅速分离胸主动脉，立即置于预冷的Krebs液，去除血管上的脂肪及结缔组织，将动脉剪成长约2 mm的血管环，置于10 mL含Krebs液的器官小室中。2根细金属丝分别由血管内腔穿过血管环，并固定于血管张力仪两端的肌动描记器装置上，将温度设定在37℃，持续充以95% O2和5% CO2的混合气体。平衡60～90 min，期间每隔15～20 min换液1次。实验血管先用10－6mol/L PE鉴别血管收缩活性，用10－5mol/L ACh检测内皮完整性，对ACh舒张大于70%认为内皮完整。冲洗血管环再次平衡至基线水平，然后进行实验。按以下公式计算舒张率:舒张率(%)=(最大预收缩的张力－舒张时的张力)/最大预收缩的张力。

2.5扫描电镜观察大鼠称重麻醉后，暴露并迅速分离胸主动脉，立即置于预冷的PBS液，小心剥离血管上的脂肪及结缔组织，暴露内皮层，并置于4%的多聚甲醛中过夜，经脱水、CO2临界点干燥、金属镀膜处理样品，于3 000倍扫描电子显微镜下观察内皮细胞。

2.6 Western blotting实验将保存的胸主动脉组织加入裂解液，于超声粉碎机下匀浆组织块，煮蛋白18 min，13 500 r/min于4℃环境下离心7 min，取上清－20℃保存。常规BCA方法蛋白定量。制备10%聚丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE 1.5～2 h，在4℃环境下转膜60 min，将蛋白转移至PVDF膜上。室温5% BSA封闭30 min，加Ⅰ抗(endothelial lipase，1∶1 000;β-actin，1∶2 000)预孵PVDF膜4℃过夜，TBST洗膜3次，加Ⅱ抗孵育1 h，TBST洗膜后在Bio-Rad凝胶成像系统中曝光。用Image Lab软件分析条带灰度，每次实验将对照组蛋白灰度值标准化为100%。

2.7 HE染色取新鲜的大鼠子宫组织并立即置于10%的甲醛溶液中固定，脱水浸蜡包埋。石蜡切片脱蜡，PBS冲洗。苏木素液浸染5 min，流水冲洗1 min，1%盐酸乙醇分化3 s，自来水返蓝。1%伊红染液2 min，中性树胶封片。

2.8血清生化指标检测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、总甘油三酯(total triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平及雌激素(estradiol，E2)水平的测定均使用日立Hitachi 7180全自动生化分析仪，由中山大学附属第一医院检验科测得。

3统计学处理

采用统计软件SPSS 17.0进行分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示。实验重复3次，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1加减一阴煎对去势大鼠内皮依赖性舒张(endothelium-dependent dilation，EDD)功能的影响

正常对照组、去势组、加减一阴煎组和E2组的最大内皮依赖性舒张率分别为(72.07±1.50) %、(42.78±3.57) %、(73.37±2.27) %和(73.26± 2.76) %，加减一阴煎组和雌激素组逆转了去势大鼠EDD的降低。各组对SNP的最大舒张率分别为(75.43±2.92) %、(72.00±1.85) %、(74.76± 3.03) %和(75.10±2.02) %，组间无显著差异，见图1。

Figure 1.Effects of Jia-jian-yi-yin decoction on endothelium-dependent dilation of thoracic aorta in ovariectomized rats.A: the dilation of thoracic aorta to ACh; B: the maximal ACh dilation; C: the dilation of thoracic aorta to SNP; D: the maximal SNP dilation.MC: middle-aged control; MO: middle-aged rats with ovariectomy; MY: middle-aged OVX rats treated with Jia-jianyi-yin decoction; ME: middle-aged OVX rats treated with estradiol valerate.Mean±SD.n=4～5.＊＊P＜0.01 vs MC.图1加减一阴煎对去势大鼠内皮依赖性舒张功能的影响

2加减一阴煎对血管内皮细胞形态的影响

扫描电镜结果显示，与正常对照组相比，去势组内皮细胞排列紊乱，局部内皮层充满疏水性的球形脂滴样物质，内皮细胞表面的微绒毛不明显。加入雌激素后，内皮细胞形态完好，排列整齐，细胞表面微绒毛丰富;补充加减一阴煎后，内皮细胞排列整齐，形态完好，细胞表面微绒毛丰富，与戊酸雌二醇组类似，见图2。

Figure 2.The observation of endothelial cells under scanning electron microscope.Red hollow triangles: lipid substances; yellow hollw arrows: microvilli.图2加减一阴煎对去势大鼠血管内皮细胞形态的影响

3加减一阴煎对内皮脂肪酶表达的影响

Western blotting结果显示，与正常对照组相比，去势组内皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)表达水平升高，加减一阴煎与戊酸雌二醇均可降低EL的表达(P＜0.05)，见图3。

Figure 3.The relative endothelial lipase expression.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs MC;#P＜0.05 vs MO.图3加减一阴煎对内皮脂肪酶表达的影响

4加减一阴煎对去势大鼠体重、血清E2和血脂水平的影响

正常对照组、去势组、加减一阴煎组和戊酸雌二醇组的体重分别为(386.67±5.77) g、(467.50± 43.49) g、(370.00±14.72) g和(385.00±32.79) g。各组的血清雌激素水平分别为(525.54±18.99) pmol/L、(318.16±21.20 ) pmol/L、(321.71± 49.59) pmol/L和(530.96±30.01) pmol/L。TC/HDL-C与TG/HDL-C的比值在去势组明显升高，加减一阴煎组与戊酸雌二醇组均降低此比值(P＜0.05)，见表1。

5加减一阴煎对子宫增生的影响

正常对照组、去势组、加减一阴煎组和戊酸雌二醇组的子宫湿重分别为(0.56±0.11) g、(0.14± 0.02) g、(0.13±0.01) g和(0.45±0.08) g，见图4; HE染色结果显示:与正常对照组相比，去势组子宫内膜上皮细胞萎缩为扁平细胞;雌激素组子宫内膜上皮增生呈柱状，且出现核下空泡;加减一阴煎组子宫内膜柱状上皮细胞部分萎缩，局部萎缩呈扁平状，见图5。

讨论

动脉粥样硬化严重威胁着绝经期妇女的生命健康安全，内皮功能紊乱是动脉粥样硬化的始动环节，内皮细胞释放的NO减少是内皮功能紊乱的重要特征［6］。在本实验中，我们选用8月龄雌鼠去势1个月给药以模拟绝经后妇女的低雌激素状态［7］，使用ACh检测EDD。本实验结果表明，与对照组相比，去势组EDD明显降低，加减一阴煎可逆转去势大鼠的EDD，而中药组与戊酸雌二醇组无差别。使用SNP检测血管舒张功能，结果显示各组对SNP直接舒张血管平滑肌的反应无差异，表明去势组EDD明显降低主要与血管内皮细胞功能受损有关;加减一阴煎改善去势大鼠的EDD主要通过作用于内皮细胞而非平滑肌细胞，此作用与雌激素改善去势大鼠的EDD类似;这提示加减一阴煎在改善去势大鼠EDD方面具有拟雌激素样作用。

表1　加减一阴煎对去势大鼠体重、血清E2和血脂水平的影响Table 1.Effects of Jia-jian-yi-yin decoction on the basic data of the rats with different treatments (Mean±SD.n=4～6)

Figure 4.The wet weight of uterine.Mean±SD.n=5～10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs MC;##P＜0.01 vs MO.图4加减一阴煎对子宫湿重的影响

Figure 5.The HE staining of uterine (×400).图5加减一阴煎对子宫内膜的影响

去势大鼠EDD的降低与内皮细胞密切相关，且药物被吸收入血后与血管内皮细胞直接相接触，因此我们检测了主动脉的舒张功能后，在电镜下观察了血管内皮细胞形态，发现与正常对照组相比，去势组内皮细胞排列紊乱，且局部内皮层充满疏水性的脂滴样物质，提示去势组EDD的降低与其内皮细胞形态受损相关，印证了去势组EDD的降低;加减一阴煎组及戊酸雌二醇组内皮细胞排列相对整齐，接近对照组水平，且脂滴样物质明显减少，提示加减一阴煎在改善去势大鼠内皮细胞形态方面也具有拟雌激素样作用，同时也印证了加减一阴煎逆转去势大鼠EDD的降低。值得一提的是，去势组内皮层局部出现了脂滴样物质，我们推测加减一阴煎及戊酸雌二醇改善去势大鼠内皮细胞形态的原因之一应与逆转去势大鼠内皮细胞脂质堆积的现象有关。

脂质代谢在动脉粥样硬化的进展中发挥重要作用，雌激素发挥血管保护作用的途径之一为调节血脂水平，降低LDL，升高HDL［8］。以上结果证实加减一阴煎可保护血管的形态和功能，是否也与调节血脂有关呢?本实验血脂结果显示，加减一阴煎和戊酸雌二醇组血脂HDL水平与对照组相比变化不大［9］，去势组HDL水平出现短暂代偿性升高。据报道TC/HDL-C和TG/HDL-C的比值预测心血管系统疾病比单纯血清HDL及LDL水平更有价值［10］，在本实验中，与正常对照组相比，去势组TC/HDL-C和TG/HDL-C比值显著升高，而中药组及戊酸雌二醇组均降低两比值至对照组水平，表明加减一阴煎的作用类似戊酸雌二醇，可改善血脂水平。

血脂中的HDL具有良好的心血管保护作用，逆向转运血管中的胆固醇需定位在其表面，而内皮脂肪酶可作为内皮细胞与脂质间连接的桥梁，除了桥接功能，EL还可水解HDL的磷脂［11］。在正常生理情况下，EL由血管内皮细胞少量合成;而在动脉粥样硬化的血管中，EL表达增加［12］。因此我们推测去势组大鼠血管内皮细胞表面脂质堆积的现象可能与EL相关。免疫印迹结果显示，加减一阴煎和戊酸雌二醇均可降低去势大鼠EL的表达，表明加减一阴煎对EL的作用也与雌激素类似。这提示加减一阴煎逆转去势大鼠内皮层脂质堆积的现象可能与EL表达下调有关，使得功能性的HDL逆转运胆固醇正常，内皮细胞对脂质的摄取利用与排出达到平衡。

在本实验中，从血管舒张功能及形态观察结果中我们证实，加减一阴煎对血管的保护具有拟雌激素样作用，但绝经后妇女补充雌激素后却伴随如子宫内膜癌［13］、静脉血栓［14］等副作用，加减一阴煎是否也具有类似的副作用还未可知。本实验中，我们选取子宫组织观察其增生情况，结果显示，雌激素可促进去势大鼠的子宫内膜增生，加减一阴煎则对去势大鼠子宫内膜的增生影响不大，这提示中药对子宫不具有拟雌激素样作用。有研究表明，加减一阴煎中的熟地［15］、地骨皮［16］、知母［17］等中草药中不仅含有黄酮类、香豆素类、三萜类等植物雌激素，也含有生物碱(如甜菜碱［18］)、甾体皂苷(如知母皂苷［17］)等其它非植物雌激素成分。而加减一阴煎中的何种成分可抑制子宫内膜的增生及其作用机制还有待我们进一步探讨。

综上所述，加减一阴煎可改善去势大鼠内皮依赖性舒张功能(EDD)，维持内皮细胞形态的完整，且对子宫内膜的增生影响不大，这为绝经后妇女提供一种更安全、更有效的治疗选择，具有一定的临床意义。［参考文献］

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通讯作者△Tel: 020-87330647; E-mail: wangth@ mail.sysu.edu.cn

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.81172525) ;广东省科技厅项目(No.2012A032500002)

［收稿日期］2015-02-07

［文章编号］1000-4718(2015)06-1008-06

［中图分类号］R363; R289.51

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.008