脑心通胶囊的HPLC指纹图谱研究及成分含量测定

苏航 何剑波 侯沛红 康小刚

脑心通胶囊是由黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎、桃仁、红花、牛膝、桂枝等16味中药制成的复方制剂，具有益气活血、化瘀通络的功效，用于中风所致半身不遂，肢体麻木，口眼歪斜，舌强语謇及胸痹所致胸闷、心悸、气促等。近年我院常用该药效果较好，尤其对改善中风后的肢体麻木，口眼歪斜，效果较好。方中含量最多的药材是黄芪，其次丹参、当归、红花等［1］。为了表征该方中的主要有效成分，笔者采用高效液相色谱(HPLC)法对其进行分析，参照中药注射剂指纹图谱的有关技术要求［2］进行试验;同时对该制剂中4个功效成分即黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸B、羟基红花黄色素A进行定量分析。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪，附 LC-20AD双泵，SPDM20A二极管阵列检测器，SIL-20ACHT自动进样器，CTO-20A柱温箱，LC/Labsoluion色谱工作站，日本岛津公司;电子分析天平，1/10万g，型号ME235S，德国塞多利斯公司;SK250-LHC超声波发生器，上海科导超声仪器有限公司。乙腈、甲醇，色谱级，美国Honeywell公司;水为自制超纯水，由Millipore纯水仪，美国millipore公司;其余为分析纯。黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、丹酚酸B、羟基红花黄色素A对照品均购自中国药品生物制品检定所;脑心通胶囊(批号20140224、20140225、20140226、201400301、20140302、20140306、20140309、20140033、20140316、2014018)，陕西步长制药有限公司。

2 指纹图谱测定方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm，瑞士 Kromasil公司);流动相:乙腈(A)－0.6%磷酸水溶液溶液(B)，梯度洗脱，0 ～30 min，A 10%→25%;30～60 min，A 25%→60%:60～65 min，A 60%→67%;65～75 min，A67%;75～95 min，A 67%→100%。记录时间为 95 min。体积流量:0.8 ml/min;柱温:30℃;检测波长:322 nm;进样20 μl。

2.2 参比物与供试品溶液的制备

2.2.1 参比物溶液的配制:精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，加流动相制成质量浓度为100 μg/ml的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品的制备:取10粒本品内容物，混匀，称取1.0 g，精密称定，置于50 ml量瓶中，加80%甲醇适量，超声 30 min，放凉，加 80%甲醇至刻度，滤过(0.45 μm 滤膜)，滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验:取供试品溶液(批号20140224)，连续进样6次，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD小于1.0%;相对峰面积RSD小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验:取供试品溶液(批号20140224)，分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样分析，考察共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间 RSD小于1.0%，相对峰面积 RSD小于2.0%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验:取供试品(批号20140224)6份，分别按供试品溶液的制备与检测方法进行检测，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。结果表明，各共有峰相对保留时间RSD小于1.0%，相对峰面积RSD小于2.0%，表明重复性良好。

2.3.4 指纹图谱建立与相似度分析:取10批样品，分别按供试品溶液的制备与检测方法进行检测，进样20 μl，记录指纹图谱，峰10为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，建立指纹图谱。10批样品共有色谱峰的相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于5.0%，符合指纹图谱研究技术的要求。运用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对10批脑心通胶囊的指纹图谱进行相似度分析，首先将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，选定33个共有峰进行谱峰匹配，通过中位数矢量计算得出样品指纹图谱的共有模式，并以此共有模式为标准，进行整体相似度评价，结果相似度为0.954～0.992，表明这10批脑心通胶囊的化学成分一致性较好。见图 1、2。

图1 脑心通胶囊HPLC指纹图谱

图2 10批脑心通胶囊的HPLC指纹图谱

3 含量测定方法与结果

3.1 色谱条件 除黄芪甲苷的检查波长为203 nm外，其余均同色谱条件“2.1”项。

3.2 对照品溶液的制备 分别精密称取羟基红花黄色素对照品6.0 mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷6.0 mg、丹酚酸 B 7.5 mg、黄芪甲苷 7.5 mg，分别置于各 5 ml量瓶中，分别加80%甲醇至刻度，摇匀，即得各对照品溶液。再分别精密量取羟基红花黄色素对照品溶液1.00 ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液 0.01 ml、丹酚酸对照品溶液 1.00 ml、黄芪甲苷对照品溶液0.05 ml置10 ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液的母液。

3.3 供试品溶液的制备 同“2.2.2”项。

3.4 线性关系的考察 分别精密量取混合对照品母液0.13、0.26、0.52、0.67、1.0 ml对照品溶液分别置于1 ml量瓶中并加80%甲醇稀释至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得5个浓度组，进样。分别以各对照品的浓度(x)为横坐标，峰面积积分值(y)为纵坐标绘制标准曲线，计算，得回归方程。见表1。

表1 各对照品的线性方程及其浓度范围

3.5 精密度试验 精密吸取上述线性对照品溶液(线性样品:0.52 ml母液)，重复进样5次，测得羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸B、黄芪甲苷的相对标准差(RSD)分别为 1.21%，1.12%，1.08%，1.02%，1.52%，表明仪器精密度良好。

3.6 重复性试验 精密称取样品(批号20140224)5份，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品，按“2.2.1”项下条件测定。结果:羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸B、黄芪甲苷平均含量与RSD值分别为 0.422mg/g、1.22%，0.036 mg/g、1.31%，2.396 mg/g、1.21%，0.078 mg/g、1.14%，表明该方法重复性良好。

3.7 稳定性试验 精密吸取上述线性对照品溶液(线性样品:0.52 ml母液)，在第 0、2、4、8、12、24 h 进样。结果:羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸 B、黄芪甲苷的峰面积的 RSD值分别为1.01%、1.34%、1.08%、1.27%、1.42%，表明该溶液在24 h内稳定。

3.8 加样回收率试验 取脑心通胶囊(批号20140224，其中羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸 B、黄芪甲苷分别为 0.422、0.036、2.396、0.078 mg/g)10 粒内容物，混匀，称取粉末 1.0 g，精密称定，分别添加混合对照品溶液(精密称取丹酚酸B对照品溶液22.5 mg置于5 ml量瓶中，再分别精密量取“3.2”项下线性对照品溶液浓度为1.2 mg/ml羟基红花黄色素 A 1.5 ml、1.2 mg/ml毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.15 ml、1.5 mg/ml黄芪甲苷 0.15 ml于量瓶，加80%甲醇至刻度)0.25、0.50、1.00 ml，照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，重复制样6份，按照“3.1”项下色谱条件测定。见表2。

表2 加样回收率试验结果

3.9 含量测定 精密称10批样品，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品，按“2.2.1”项下条件测定。结果，羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸B、黄芪甲苷含量(mg/粒，0.4 g/粒)分别为 0.169、0.014、0.965 和 0.032 mg/粒，RSD(%)分别 1.37、1.67、0.95 和 1.57%。

4 讨论

4.1 波长的选择 采用全波长对脑心通胶囊样品进行测定，并采集其三维色谱图，通过综合考虑该三维色谱图在所有波长下出峰的多少，和各成分的分离情况以及各色谱峰的丰度，最后选定322 nm作为指纹图谱定性与羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹酚酸B定量的波长，而在此波长下黄芪甲苷吸光度太小，因此依据文献［3］选择203 nm作为其定量波长。

4.2 洗脱系统的选择 由于等度洗脱，各成分分离度小或不能分开，所以选择梯度洗脱。并对不同流动相系统(甲醇-水、乙腈-水、乙腈－1.0%醋酸水溶液以及乙腈－0.6%磷酸水溶液)及其不同流动相比例进行了比较，结果以乙腈－0.6%磷酸水溶液系统为最佳，其图谱上各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中，因此选此流动相系统作为脑心通胶囊HPLC指纹图谱检测的流动相。

4.3 制样方法 依据文献［4］，比较了不同溶剂(甲醇、水)、不同提取方(超声、即热回流、浸渍)、不同浓度的甲醇(50%、60%、70%、80%、90%)等。结果表明:80%甲醇超声30min提取，得峰面积较大、峰个数较多、分离度较好。

4.4 检测成分的选择 依据文献［1］，黄芪是处方中含量最高的药材，其主要活性成分为黄芪甲苷［5］、毛蕊异黄酮葡萄糖苷［6］等，同时该制剂对两种成分分析报导较少。另外还检测了含量较高的其他药材中的两个成分以达到制剂质量控制的目的。

通过上述指纹图谱及对照品比对初步分析，发现众多有效成分且部分含量较高，所以临床效果较好。同时通过该制剂HPLC指纹图谱分析与10批次制剂中的4个物质含量测定，结果含量均一。鉴于上述两方法准确、稳定、操作简单易于实施，因此两方法均可用于作为脑心通胶囊的质量评价方法。

1 WS-10001(ZD-0001)-2002.中成药标准汇编-脑系经络肢体分册.2002，225.

2 关于印发≤中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的通知.中国药品标准，2000，1:3-4.

3 闵庆璐，张世轩，陈晓明.HPLC－UV法测定丹黄祛瘀片中黄芪甲苷的含量.中华中医药学刊，2011，29:1678-1681.

4 李耿，孟繁蕴，杨洪军，等.UPLC法同时测定脑心通胶囊中5个成分的含量.药物分析杂志，2013，33:414-418.

5 刘天一，何观虹，姚丽.黄芪甲苷治疗心血管疾病研究进展.中医药信息，2013，30:117-121.

6 赵晓莉，潘鹏，周乐，等.毛蕊异黄酮葡萄糖苷大鼠在体肠吸收动力学的研究.南京中医药大学学报，2012，28:552-554.