辛伐他汀通过抑制RhoA/Rho激酶活性预防冠状动脉痉挛机制研究

刘骅增 谢莲娜

冠脉痉挛可引起变异型心绞痛、不稳定型心绞痛、急性心肌梗死等缺血性心脏病，其中，血管内皮细胞功能障碍及血管平滑肌细胞收缩反应增强被认为是冠脉痉挛的主要机制。RhoA/Rho激酶信号转导通路是血管平滑肌细胞钙离子敏感性的主要调节机制，其参与血管痉挛、动脉硬化及缺血再灌注损伤的病理生理过程，具有缓解血管平滑肌痉挛及改善内皮功能的作用，已经成为心血管病治疗的新靶点。他汀类药物是一种Rho激酶抑制剂，除降胆固醇作用外，还具有抑制炎性反应、改善内皮功能、抗氧化等作用［1，2］。本研究探讨辛伐他汀改善大鼠冠脉痉挛的作用机制，为拓展冠脉痉挛治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 40只12周龄Wistar大鼠(体重250～300 g)随机分为4组(n=10):对照组、辛伐他汀组、Rho激酶抑制剂(法舒地尔)组和联合用药组(辛伐他汀+法舒地尔组)。所有大鼠实验前置于室温18～22℃、湿度60% ～70%、通风良好的清洁饲养室内饲养1周。

1.2 动物给药及冠脉痉挛模型构建 所有动物在冠脉痉挛模型构建前分为以下4组进行给药处理:空白对照组:不用药;他汀组:5 mg·kg－1·d－1辛伐他汀灌胃;Rho激酶抑制剂组:15 mg·kg－1·d－1法舒地尔腹腔注射;联合用药组:5 mg·kg－1·d－1辛伐他汀灌胃+15 mg·kg－1·d－1法舒地尔腹腔注射，所有用药连续7 d。第8天，将大鼠仰卧固定在鼠板上，麻醉采用腹腔注射麻醉，按照40 mg/kg给予1%戊巴比妥钠进行腹腔注射。动物麻醉后，连接体表心电图，然后分别从大鼠尾动脉注射0.1 U/kg精氨酸加压素(AVP)，用以制备冠脉痉挛模型。之后持续监测心电图变化，观察心电图S-T段变化;如果空白对照组S-T段持续偏移，则提示冠脉痉挛模型制作成功，如果药物处理组S-T段不出现明显偏移，则提示药物发挥预防作用。

1.3 RhoA/Rho激酶活性的测定 所有大鼠采用大剂量苯巴比妥钠处死，放血开胸暴露心包，迅速取出心脏，将标本制成匀浆，冰浴、离心，取上清液在液氮中速冻后置于－80℃冰箱中保存备用。然后采用实时荧光定量PCR分析Rho激酶基因在冠脉痉挛大鼠用辛伐他汀和法舒地尔处理后的相对表达量。采用Western blot检测 RhoA、GTP-RhoA、肌球蛋白磷酸酶靶亚基(MYPT1)和磷酸化MYPT1(p-MYPT1)蛋白的表达，并计算RhoA蛋白的相对活性和Rho激酶的相对活性。计算公式:RhoA蛋白的相对活性=GTP－RhoA蛋白表达量/总RhoA蛋白表达量;Rho激酶的相对活性=p－MYPT1蛋白表达量/MYPT1蛋白表达量。Realtime PCR试剂盒购自美国QIAGEN公司;RhoA活性检测应用RhoA活性分析试剂盒(NewEast Biosciences，美国)进行，试剂盒内含anti-GTP-RhoA和anti-RhoA抗体;anti-MYPT1和anti-p-MYPT1抗体购自美国Sigma公司。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列表

1.4 统计学分析 应用SPSS 18.0统计软件，计量资料以±s表示，两样本均数的比较采用t检验，多组间均数比较用单因素方差分析检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辛伐他汀保护大鼠心脏功能 在诱导大鼠冠脉痉挛后，心电图监测结果在空白对照组，S-T压低，上下均偏移超过0.9 mV;在他汀组，大鼠心肌功能所受影响不大，S-T压有轻微的偏移，结果与Rho激酶抑制剂组相似;联合用药组，S-T段接近于等电位线，无明显偏移，提示联合辛伐他汀和法舒地尔可有效预防大鼠心脏功能。见图1。

图1 大鼠冠脉痉挛模型诱导后心电图改变情况

2.2 Rho激酶mRNA相对表达量 大鼠心脏组织用于提总RNA，real-time PCR检测Rho激酶mRNA相对表达量。他汀组中Rho激酶基因表达有一定程度下降，但差异无统计学意义(P＞0.05);Rho激酶抑制剂组中Rho激酶基因表达显著下降，与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，但与他汀组相比差异无统计学意义(P＞0.05);联合用药组Rho激酶基因表达显著减少(P＜0.05)。提示联合辛伐他汀和法舒地尔可有效降低Rho激酶基因的表达，可能与辛伐他汀能预防大鼠冠脉痉挛相关。见表2。

表2 大鼠用药后Rho激酶mRNA相对表达量 ±s

表2 大鼠用药后Rho激酶mRNA相对表达量 ±s

注:与空白对照组比较，*P ＜0.05

组别 Rho激酶mRNA 相对表达量空白对照组1.00 ±0.00他汀组 0.81 ±0.04 Rho激酶抑制剂组 0.43 ±0.03*联合用药组 0.37 ±0.03*

2.3 RhoA蛋白活性和Rho激酶活性 大鼠心脏组织用于提总蛋白，RhoA活性分析试剂盒检测RhoA蛋白的相对活性，Western blot检测Rho激酶的相对活性。他汀组和Rho激酶抑制剂组中RhoA蛋白的相对活性和Rho激酶的相对活性均有一定程度下降，但差异无统计学意义(P＞0.05);但在联合用药组，RhoA蛋白的相对活性和Rho激酶的相对活性均显著下降(P＜0.05)，提示两种药物可协同作用抑制RhoA/Rho激酶活性，来治疗冠脉痉挛大鼠模型。由于Rho激酶的活性是通过其特异性下游底物MYPT1的磷酸化程度来检测的，Western blot结果也可见p-MYPT1表达在联合用药组显著下降。见表3、图2。

表3 RhoA蛋白和Rho激酶的相对活性n=10，±s

表3 RhoA蛋白和Rho激酶的相对活性n=10，±s

注:与联合用药组比较，*P ＜0.05

组别 RhoA蛋白相对活性 Rho 激酶相对活性他汀组 0.75 ±0.19* 0.68 ±0.16*Rho激酶抑制剂组 0.71 ±0.11* 0.50 ±0.13*联合用药组0.52 ±0.13 0.40 ±0.17

图2 Western blot检测p-MYPT1和MYPT1蛋白的表达

3 讨论

研究表明，他汀类药物具有降脂、抑制炎性反应、改善内皮功能、抗氧化等多种生理作用，其多效性与RhoA/Rho激酶信号转导通路关系密切［3］。RhoA是类异戊二烯介质的主要靶点，他汀类药物通过抑制类异戊二烯的生成而影响Rho的膜定位功能及其对下游效应分子Rho激酶的激活作用［3，4］。已知Rho蛋白是小GTP结合蛋白，控制多重生物信号途径，在血管平滑肌细胞的增殖、细胞形态的维持、平滑肌的细胞收缩、细胞的黏附以及血小板集聚方面发挥着重要作用。Rho激酶是一种分子量约为160 kD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Rho激酶有ROCK1和ROCK2两种异构体;Rho激酶主要存在于细胞浆及细胞核，是调节细胞运动的重要激酶之一，Rho激酶的过度激活或高表达均可引起疾病的产生［5，6］。在本研究中，我们发现在大鼠冠脉痉挛模型中Rho激酶活性会增高，表明模型构建成功。

已知Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔是一种新型异喹啉磺胺衍生物，可以有效缓解脑血管痉挛，最初主要应用于脑血管疾病。近年来，其相关研究不断深入，其临床应用不断拓展，也被认为是一种新型高效的心血管保护药物［7］。本研究在建立大鼠冠状动脉痉挛动物模型前采用辛伐他汀、法舒地尔以及联合辛伐他汀和法舒地尔处理大鼠，以期通过药物预防大鼠冠脉痉挛，结果发现辛伐他汀在改变RhoA蛋白的相对活性、Rho激酶的相对活性等方面，其作用效果与法舒地尔组相当，进一步研究显示，二者联合用药加强了对Rho激酶的抑制作用，提示他汀类药物能够有效预防冠脉的痉挛，可明显改善缺血心肌的血供，并提高运动耐力，从而有效降低心脏事件的发生率，与相关研究结果［8－10］一致。

综上所述，辛伐他汀具有预防冠脉痉挛的作用，并且通过抑制RhoA/Rho激酶活性而作用的，其可能在防治冠脉痉挛方面具有重要的作用。但目前在临床实践中他汀类药物具有预防冠脉痉挛的作用尚没有得到广泛的认可，相关的作用机制还有待进一步做深入的研究，相信随着对其研究的不断深入，为拓展冠脉痉挛的治疗提供新的思路。

1 Silveira AA，Dominical VM，Lazarini M，et al.Simvastatin abrogates inflamed neutrophil adhesive properties，in association with the inhibition of mac-1 integrin expression and modulation of rho kinase activity.Inflamm Res，2013，62:127-132.

2 Zhang Z，Wang M，Xue SJ，et al.Simvastatin ameliorates angiotensin iiinduced endothelial dysfunction through restoration of rho-bh4-enos-no pathway.Cardiovasc Drugs Ther，2012，26:31-40.

3 王高频，杨雪佳，史晓静，等.阿托伐他汀抑制内皮细胞Rho/Rho激酶信号通路改善细胞骨架.中华老年心脑血管病杂志，2012，14:752-755.

4 武星，李虹伟，李卫萍，等.Rho激酶与心血管疾病.中国心血管杂志，2011，16:393-395.

5 Ma MM，Li SY，Wang M，et al.Simvastatin attenuated cerebrovascular cell proliferation in the development of hypertension through rho/rho-kinase pathway.J Cardiovasc Pharmacol，2012，59:576-582.

6 Li CB，Li XX，Chen YG，et al.Simvastatin exerts cardioprotective effects and inhibits the activity of rho-associated protein kinase in rats with metabolic syndrome.Clin Exp Pharmacol Physiol，2012，39:759-764.

7 张慧.Rho激酶抑制剂法舒地尔在冠心病中的应用进展.中国心血管病研究，2012，10:708-711.

8 Xiao Y，Liang L，Pan Y，et al.Inhibitory effects of simvastatin on migration and invasion of rheumatoid fibroblast-like synoviocytes by preventing geranylgeranylation of rhoa.Rheumatol Int，2013，33:389-399.

9 Voora D.A transcriptomics-informed genetic association study identifies rhoa in simvastatin-induced low-density lipoprotein cholesterol lowering.Circ Cardiovasc Genet，2013，6:137-138.

10 蒋卫红，谭丽华，杨侃，等.RhoA/Rho激酶在氟伐他汀对组织因子表达影响中的调控作用.中国动脉硬化杂志，2012，20:117-120.