孟鲁司特对失血性休克复苏致急性肺损伤大鼠肺组织MDA、GSH的影响及肺保护作用

涂青梅 田刚 郑敏 姜祯珍 罗兴均 赵翔

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)是一种常见的并发症，由严重的外伤或手术创伤引起。失血性休克复苏(hemorrhagic shock followed by resuscitation，HSR)也被认为是一种损伤，因为它可以经常引起全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，结果可能会导致MODS，其中包括急性肺损伤(acute lung injury，ALI)。ALI是临床医生面临的主要问题，导致发病率和病死率明显升高［1］。HS引起的SIRS的发病机制很复杂，与很多病理生理机制都有关系。目前被大部分人接受和认可的机制是缺血再灌注(ischaemia and reperfusion，I/R)以及对自身免疫细胞的刺激［2］。I/R损伤本身就可以诱发炎性反应，增加细胞因子的释放、活性氧的生成、内皮细胞活化、一氧化氮产量和粘附分子的表达［2］。HS发生后，被激活的中性粒细胞浸润到受损肺部，内皮细胞粘附分子的表达增加，局部细胞因子水平也升高［1］。作为一种具有选择性和可逆性的半胱氨酰白三烯1(cysteinyl leukotriene 1，CysLT1)受体拮抗剂，孟鲁司特常被用于治疗过敏性鼻炎和哮喘［3］。对消炎药诱发的溃疡以及阿伦磷酸钠引起的大鼠胃黏膜损伤，孟鲁司特都具有胃保护作用，原因是减轻了氧化损伤和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性［4］。此外，由于其具有抗炎抗氧化作用，孟鲁司特可减轻I/R引起的多种脏器的氧化损伤［5］。我们前期的研究发现，白三烯的生物合成可以减轻HS引起的肺损伤［6］。然而，孟鲁司特对HSR所致ALI的影响和作用，笔者尚未见文献报道。本研究观察孟鲁司特对HS大鼠肺组织丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的影响，探讨孟鲁司特的肺保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 成年健康SD大鼠(SPF级)24只，体重200～250 g，雌雄不限，由湖北医药学院实验动物中心提供。24只大鼠随机分为3组(n=8):假手术组(Sham组)、失血性休克复苏致急性肺损伤模型组(HS组)、孟鲁司特治疗组(M组)。Sham组:在相同的时间内接受相同的麻醉和手术过程成为休克动物，但既不是失血性休克也不进行液体复苏;HS组:经过心脏内穿刺放血 1 h，失血量约为 50%(30 ml/kg)，失血性休克后再用林格氏液复苏1 h，然后一直保留到实验结束;M组:在放血前30 min接受孟鲁司特7 mg/kg腹腔内注射，在再灌注之前同样的剂量再注射1次［5］。Sham组和HS组都接受了等量的乙醇溶液。

1.2 失血性休克模型的建立 用10%的水合氯醛350 mg/kg经大鼠腹腔注射麻醉。从左侧胸部进行心脏内穿刺，放血时间超过2 min以上，放血量为50%(30 ml/kg)，大鼠处于休克状态持续时间为 1 h［4］，之后通过尾部静脉输注乳酸林格氏溶液进行复苏，输液量为失血量的2倍(60 ml/h)，输液时间超过1 h以上。除了不放血和不复苏之外，Sham组进行所有的实验程序。整个实验过程中，大鼠均保持自主呼吸。复苏后2 h，大鼠被再次麻醉后从胸腔打开处放血处死，直接从心脏抽取血液样本。保留肺组织，左肺制成匀浆储存起来供研究使用;右肺用10%甲醛固定进行组织学检查。

1.3 氧化应激测量的组织制备 通过超声波液体处理器使肺标本成为均质微粒，再用含0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲盐水进行处理，得到肺组织匀浆。4℃下，匀浆以 10 000 r/min离心15 min，保留上清以测定GSH和MDA［7］。作为脂质过氧化反应的产物，通过监测硫代巴比妥酸反应物质形成，从而对 MDA的水平进行分析。使用 1.56×105mol·L－1·cm－1的消光系数，MDA 类似物的脂质过氧化反应被表达出来，表达形式为nmol MDA/g(组织)。使用412 nm比色法对GSH进行测定。

1.4 组织取样及组织病理学检查 实验结束时，处死大鼠并取肺组织，用10%的甲醛缓冲液立即固定所有组织病理学标本，进行常规处理。显微镜下观察部分标本的组织病理学改变。采用Matute-Bello等［8］创立的评分系统对肺损伤程度进行评估。该评分系统对肺泡间质内充血、肺泡内细胞浸润以及肺泡出血进行分级。每项指标被分为0～3级:肺泡间质细胞，0:肺间质细胞稀少;1级:肺间质细胞＜1/3视野;2级:肺间质细胞占据1/3～2/3视野;3级:肺间质细胞＞2/3视野。肺泡内细胞浸润:0级，每视野肺泡内皮细胞＜5个;1级:每视野肺泡内皮细胞5～10个;2级:每视野肺泡内皮细胞11～20个;3级:每视野肺泡内皮细胞＞20个。肺泡出血，0级:没有出血;1级:1～5个肺泡中，每个肺泡至少5个红细胞;2级:5～10个肺泡中，每个肺泡至少5个红细胞;3级:＞10个肺泡中，每个肺泡至少含5个红细胞。单项指标得分相加，得到总的肺损伤评分。依据评分，肺损伤被分为三级:正常(0分);轻度(1～3分);中度(4～6分);重度(7～9分)。组织学切片由病理科医生观察评估。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠肺组织MDA、GSH水平变化 作为肺组织脂质过氧化反应的一个主要降解产物，HS组大鼠肺组织MDA水平与Sham组相比明显升高(P＜0.05);而与HS组相比，M组大鼠肺组织MDA水平则有明显降低(P＜0.05)。与Sham组相比，HS组大鼠肺组织GSH水平明显降低(P＜0.05)，而M组则无明显差异(P＞0.05)。见表1。

表1 3组大鼠肺组织MDA、GSH水平比较n=8，±s

表1 3组大鼠肺组织MDA、GSH水平比较n=8，±s

注:与 Sham 组比较，*P ＜0.05;与 HS 组比较，#P ＜0.05

组别 MDA(nmol/g) GSH(μmol/g)Sham组95.0 ±2.8 4.36 ±0.27 HS 组 157.0 ±6.2* 2.12 ±0.25*M 组 115.1 ±5.2#3.54 ±0.40

2.2 3组大鼠急性肺损伤评分比较 Sham组大鼠的肺组织切片显示，所有3个参数的表现均为正常(肺间质细胞稀少，无肺泡内细胞浸润，无肺泡出血)。HS组与Sham组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，HS组总平均评分显示为中度肺损伤。与HS组比较，M组大鼠肺损伤明显减轻(P＜0.05)。总平均评分显示轻度肺损伤。见表2。

表2 3组大鼠急性肺损伤评分比较n=8，分，±s

表2 3组大鼠急性肺损伤评分比较n=8，分，±s

注:与 Sham 组比较，*P ＜0.05;与 HS组比较，#P ＜0.05

组别 肺泡间质充血 肺泡细胞浸润 肺泡出血 总分 总分分级Sham组0000正常HS组 1.50±0.34 2.50 ±0.22 1.83±0.16 5.83 ±0.60* 中度M 组 1.00 ±0.25 1.33 ± 0.42 0.50 ±0.34 2.33 ±0.56#轻度

3 讨论

HS会引起生化和组织学变化，从而导致ALI的发生。孟鲁司特可以阻止HS后的生化改变，对肺组织有保护作用。Eun等项研究中证实，脂氧合酶5通路产物能够减轻 HS后的急性肺损伤［9，10］。

通过新陈代谢试验，GSH已被证实在宿主抗氧化应激反应中发挥了重要作用。氧化应激的另一个重要因素是MDA，它是自由基活化的标志。据报道，氧化应激可以明显升高MDA水平而降低GSH水平，因此氧化应激很可能是HSR发病机制的一个重要因素［4］。本研究结果与Kilicogluet等［11］报道一致。本研究结果显示，与HS组相比，孟鲁斯特可明显减少休克大鼠肺组织MDA水平的升高，同时明显升高肺组织GSH的水平，这就提示孟鲁斯特对HS诱导的氧化肺损伤有一定的保护作用。Seneret等［12］发现，在慢性肾功能衰竭导致的其他器官损伤模型中，孟鲁司特可明显降低肺组织MDA水平，同时升高肺组织GSH的水平。此外，有研究证实，孟鲁司特通过其抗炎和抗氧化作用，可减轻大鼠肝脏、膀胱、睾丸和肾脏因I/R引起的氧化性损伤［4］。孟鲁司特的抗氧化能力，一方面基于其自身作用，更重要的是因为它的抗炎作用，促炎细胞因子、趋化因子和被激活的补体因子会导致中性粒细胞的增加和随后再灌注阶段中性粒细胞引起的氧化应激。通过激活信号增加IL-8的生成，LTC4可影响GSH与GSSG的比率，如果用白三烯受体拮抗剂孟鲁司特预处理，可明显抑制LTC4诱导的细胞内氧化还原反应时间依赖性变化，也通过抑制NF-κB的激活来抑制IL-8生成的上调［13］。另一方面，白三烯与炎性介质关系密切，因为他们都有增加血管通透性的能力，这是I/R损伤的共同特征。

HS组总的平均分提示中度肺损伤，其中66.7%大鼠为中度肺损伤，33.3%大鼠为重度肺损伤。与HS组相比，孟鲁司特对大鼠的治疗明显减轻了肺损伤，M组总的平均分提示轻度肺损伤。虽然没有数据表明孟鲁司特对HS大鼠肺实质有保护作用，但Souza等证实了孟鲁司特的治疗可以改善退化的肺上皮细胞，明显降低慢性肾功衰引起的多器官损伤大鼠肺部炎症细胞的数量。此外，孟鲁司特可预防发热引起的肺损伤，因为它可以改善肺间质出血引起的大量肺泡结构紊乱和消失［14］。以I/R为模型的各种研究表明，孟鲁司特可以延缓不同器官的组织病理学变化，包括肝脏、肾脏和睾丸。本研究中，孟鲁司特的抑制作用主要归因于其平衡氧化-抗氧化状态的能力以及减少促炎介质的产生，也可能抑制了中性粒细胞的激活和渗透。

综上所述，孟鲁司特能够减轻失血性休克复苏大鼠肺组织MDA水平的升高，从而减轻肺损伤，具有一定的肺保护作用。

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