氨磷汀对小鼠肠型急性放射病的防护作用及其机制

赵致维,崔 宇,王丽梅,善亚君,柳晓兰,唐红卫,从玉文

氨磷汀对小鼠肠型急性放射病的防护作用及其机制

赵致维1,2,崔 宇2,王丽梅2,善亚君2,柳晓兰2,唐红卫3,从玉文2

目的 研究氨磷汀(amifostine, WR2721)对小鼠肠型急性放射病的防护作用及其机制。方法 建立小鼠肠型急性放射病模型。C57BL/6J小鼠随机分为对照组和WR2721给药组,接受15 Gy60Co-γ全身照射，照后移植健康小鼠骨髓细胞，观察小鼠受照后30 d的存活率和平均生存时间，以及用隐窝细胞微克隆实验，研究照后3.5 d隐窝细胞数量及小肠黏膜情况。结果 对照组小鼠均在10 d内死亡，WR2721给药组存活率提高到80%；对照组和WR2721给药组平均隐窝数分别为(6.1±0.7)个、(28.0±1.1)个，差异有统计学意义(P<0.0001)；对照组和WR2721给药组绒毛高度分别为(51.48±2.04)μm、(73.29±3.24)μm，差异有统计学意义(P<0.0001)。结论 WR2721对肠型急性放射病小鼠有保护作用，通过提高隐窝干细胞增殖活性，促进黏膜的恢复，提高小鼠的存活率。

WR2721；防护；肠型急性放射病；机制

肠型急性放射病是机体受到大剂量照射后，出现以呕吐、腹泻、血水便等胃肠道症状为主要特征的极严重的急性放射病。当机体受到>10 Gy照射后，小肠干细胞出现死亡，绒毛不可逆损伤，整个消化道上皮失去完整性，导致吸收不良、液体丢失和电解质紊乱，从而促使肠道菌群进入血液，最终引起菌血症而死亡[1,2]，死亡时间一般为7～10 d。目前，肠型急性放射病的主要治疗手段是全身阶段性应用高强抗生素防治细菌感染[3,4]，及补充电解质等对症治疗，但因缺乏特效的防治药物，最终死于败血症和多器官衰竭。因此开发安全有效的辐射防护剂逐渐引起科学家的重视。

氨磷汀(WR2721)是一种磷酸化巯基胺，作为细胞广谱保护药，被FDA批准用于头颈部肿瘤的辐射保护药。WR2721在体内通过其活性成分WRl065发挥作用，清除放射引起的氧自由基，保护正常细胞，促进造血细胞恢复[5-7]。研究表明，WR2721对放射引起的小肠损伤有保护作用[8,9]，但对大剂量照射引起的肠型急性放射病的辐射保护作用很少报道。本实验通过照射后骨髓细胞移植建立肠型急性放射病模型，客观地评价WR2721对肠型急性放射病的辐射保护作用，探讨防护作用的初步机制，为其应用于肠型急性放射病的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 WR2721购自解放军军事医学科学院条件处；5-溴脱氧尿嘧啶核苷购自北京中杉金桥生物技术有限公司；抗尿嘧啶核苷抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠二步试剂法(PV-6002)购自北京中山金桥生物技术有限公司；甲醛溶液购自天津市福晨化学试剂有限公司；伊红染液(AR-0731) 购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；苏木紫染液购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 ；肝素钠注射液购自江苏万邦生化医药股份有限公司；胎牛血清购自北京元亨金马生物技术开发有限公司。

1.2 动物来源与给药 C57BL/6小鼠，雄性，体重22～23 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，每笼5只饲养在军事医学科学院SPF级实验动物中心。标准饲料经60Co-γ射线照射除菌后喂养，饮用水消毒后供小鼠自由饮用。实验分组每组10只，对照组照前腹腔注射生理盐水0.2 ml， WR2721给药组照射前30 min腹腔注射WR2721 150 mg/kg。

1.3 照射 将装有实验动物的有机玻璃盒置于铅板背面，接受剂量率约为55 cGy/min的屏蔽后的全身照射。

1.4 小鼠照后骨髓细胞移植 将供体小鼠处死，取双侧股骨，冲出骨髓细胞，1300 r/min离心5 min，去掉上清，收集骨髓细胞，1640培养液定容至4 ml，重悬沉淀，制备骨髓单细胞悬液。取10 μl细胞悬液，用3%冰醋酸稀释后计数，根据计数结果，调整细胞浓度。受体小鼠经尾静脉移植骨髓细胞5×106个/只。

1.5 隐窝细胞微克隆实验 取材前3 h Brdu 120 mg/kg掺入，每只0.2 ml腹腔注射。剖腹取小肠，每只小鼠各截取5个1 cm的肠管，放在包埋盒里，固定于10%福尔马林24 h。小肠组织经过脱水、包埋、切片等前期处理，柠檬酸钠水浴30 min，盐酸酸化25 min、胃蛋白酶消化12 min，3%H2O215 min，血清封闭1 h后，抗Brdu抗体4 ℃过夜，小鼠二步法(PV-6002)1 h，DAB显色10 sec，苏木染色1 min，脱水封片。DAB染色为深棕色的细胞为阳性细胞，逐个肠环计数，每组至少15个肠环。

1.6 HE染色 剖腹取小肠，每只小鼠各截取5个1 cm的肠管，放在包埋盒里，固定于10%甲醛溶液24 h。小肠组织经过脱水、包埋、切片等前期处理，苏木染色1 min，伊红染色15 s，脱水后封片。

2 结 果

2.1 小鼠肠型急性放射病模型的建立 肠型急性放射病小鼠主要是胃肠损伤，即使给予骨髓移植恢复造血，也不能延长存活时间，死亡时间在7～10 d。正常小鼠在分别接受 13、14、15、16 Gy照射后6 h进行健康小鼠骨髓细胞移植，结果显示：13 Gy照射组小鼠存活率为70%；14 Gy照射组存活率为50%；15 Gy、16 Gy照射组小鼠均在7 d内死亡，平均存活时间分别为(6.0±0.9) d，(5.3±0.9) d(图1A)。通过HE染色观察小肠形态发现，13Gy与14Gy照射组与正常小鼠相比小肠绒毛开始脱落、缩短，绒毛数量减少；15Gy、16Gy照射组小肠绒毛脱落明显、数量明显减少，上皮不完整(图1B,1C)。综合以上结果说明15Gy、16Gy这两个照射剂量下可达到肠型急性放射病损伤程度，肠型急性放射病模型建立成功。

2.2 WR2721对肠型急性放射病小鼠存活的影响 对照组、WR2721给药组同时接受15 Gy照射，照后6 h移植健康小鼠骨髓细胞，结果如图2所示：对照组联合骨髓细胞移植后小鼠在10 d内死亡，平均存活时间为(5.6±0.5) d，WR2721给药组联合骨髓细胞移植后存活率提高到80%。应用Mantel log-rank方法进行生存分析， WR2721组P<0.0001，与IR组相比差异具有统计学意义。结果表明，WR2721能显著提高肠型急性放射病小鼠的存活率。

2.3 WR2721对肠型急性放射病小鼠隐窝及黏膜损伤的保护作用 3.5 d隐窝细胞微克隆实验是评价隐窝干细胞再生能力的重要指标，5个或5个以上阳性细胞计为一个再生隐窝， Brdu标记细胞增殖，在隐窝细胞计数上更准确、清楚、主观判断成分减低，误差更小。实验结果显示，对照组隐窝细胞数明显减少，平均隐窝数为(6.1±0.7)个；WR2721给药组平均隐窝细胞数为(28.0±1.1)个，P<0.0001,与对照组相比差异有统计学意义。实验结果表明，WR2721可以明显促进隐窝细胞的再生(图3A)。

图1 肠型急性放射病模型的建立

图2 WR2721对肠型急性放射病小鼠存活的影响

小肠绒毛3～5 d更新1次，如果隐窝干细胞不能补充损伤的上皮细胞，小肠绒毛就会脱落。HE染色观察照后5 d小鼠小肠黏膜，如图3B所示对照组小鼠绒毛大部分脱落，残存的绒毛高度缩短，上皮细胞连接不完整，隐窝细胞减少；与对照组相比，WR2721给药组小鼠绒毛高度增加，脱落减少，用Image-pro plus6.0软件对绒毛高度进行测量，对照组绒毛高度(51.48±2.04)μm，WR2721给药组绒毛高度(73.29±3.24)μm，差异有统计学意义(P<0.0001)。

3 讨 论

目前，国内外研究和开发了多种对骨髓型急性放射病有效的辐射防护剂，如5-AED、rhTPO、rhlL-12，但对肠型急性放射病有效的防护药物还没有发现，因此开发有效的肠型急性放射病防护药物成为研究热点。动物存活作为评价药物的一个重要指标，应用全身照射，胃肠和造血等多器官受损，很难分辨出小鼠是死于胃肠损伤还是造血损伤，因此本

图3 WR2721对肠型急性放射病小鼠隐窝细胞及绒毛的影响

实验应用照后6 h联合骨髓细胞移植，早期进行造血重建，避免造血损伤对存活的远期影响，客观的评价WR2721对肠型急性放射病的防护作用。

辐射直接导致小肠隐窝快速增殖的上皮细胞死亡，隐窝干细胞无法补充和更新小肠绒毛处的上皮细胞，导致绒毛的死亡、脱落[10]。近年来，隐窝干细胞特征标志的不断被发现，Bmi1和Hopx蛋白分别是+4位隐窝干细胞特征标志；Bmi1阳性细胞主要分布于小肠上1/3处，而Hopx阳性细胞分布在全部小肠，这些细胞为小肠隐窝多功能干细胞，且Lgr5阳性CBC细胞和Bmi1或Hopx阳性+4位隐窝干细胞可以相互转换[11,12]。Lgr5标记的连续分裂的隐窝干细胞主要用于维护肠黏膜稳态重建，而Bmi1标记的静态的隐窝干细胞主要参与放射等损伤后的肠黏膜重建[13]。

WR2721对肠型急性放射病的辐射防护作用机制复杂，推测其可能的机制：一方面WR2721提高细胞核P53的积累，细胞周期阻滞，促进DNA的修复[14,15]，减少凋亡[16]，促进隐窝干细胞的增殖；另一方面，放射不仅引起干细胞的损伤，还会影响造血微环境。电离辐射可诱导血管内皮细胞凋亡，导致血管功能障碍、出血，以及新血管生成困难增加[17,18]。有研究表明，WR2721增加微血管密度、血管厚度，促进新生血管形成，促进内皮细胞增殖[19-21],这可能也是其对肠型急性放射病有辐射防护作用的原因。另外，WR2721可以减少血浆IL-2水平，抑制放射引起的免疫反应和提高粒细胞集落刺激因子，这些都有利于放射损伤的组织修复[22]。WR2721对肠型急性放射病的辐射防护作用是否通过上述机制介导，还有待进一步研究。

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(2015-01-20收稿 2015-03-09修回)

(责任编辑 岳建华)

Protective effect and mechanism of amifostine on intestinal acute radiation sickness

ZHAO Zhiwei1,2, CUI Yu2,WANG Limei2, SHAN Yajun2,TANG Hongwei3,and CONG Yuwen2.

1.Graduate School，Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, China;2.Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Science，Beijing 100850，China;3.Department of Gastroenterology,The General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing100039，China

Objective To study the radioprotection effect and mechanism of amifostine (WR2721) on intestinal acute radiation sickness. Methods Based on the intestinal acute radiation sickness model, C57BL/6J mice were randomly divided into control group and group WR2721. Bone marrow cells from healthy mice were transplanted after 15 Gy60Co-γ shielded body irradiation. Then the survival rate in 30 d after irradiation, and the number of proliferative crypt cells and the small intestine mucosa situation with micro-cloning survival assay of mouse crypt cells at 3.5d post-irradiation were observed . Results The mice in control group died within 10 days, survival rate in WR2721 administrered group increased to 80%; in the control group and WR2721 drug group, the average number of crypts were 6.1±0.7, 28±1.1, the difference was statistically significant (P<0.0001); in control group and WR2721 administered group, villus heights were(51.48±2.04)μm, (73.29±3.24)μm, the difference was statistically significant (P<0.0001). Conclusions WR2721 has significantly radioprotective effect on intestinal acute radiation sickness by improving the survival rate of mice, promoting crypt cells regeneration and protecting the intestinal mucosa.

WR2721；radioprotection；intestinal acute radiation sickness; mechanism

国家新药创制重大专项(2013ZX09J13102-02C)；国家自然科学基金面上项目(81272997)

赵致维，硕士研究生，医师，E-mall：happyzhaozhiwei@163.com

1.221000，徐州医学院；2.100850北京，解放军军事医学科学院放射研究所；3.100039 北京，武警总医院消化内科

唐红卫，E-mall：thwwjp@hotmail.com

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