薄层色谱法鉴定蓝狐胆汁及其牛磺熊去氧胆酸对四氯化碳肝损伤的保护作用

周 博，贾竞波，李佳铭

薄层色谱法鉴定蓝狐胆汁及其牛磺熊去氧胆酸对四氯化碳肝损伤的保护作用

周 博1，贾竞波2，李佳铭3

目的 确定蓝狐胆汁的药理作用。方法 取30只昆明种小鼠，分为5组，每组6只。分别为：(1)空白组，非肝损伤处理，投喂蒸馏水，注射无伤害性的豆油；(2)模型组，肝损伤处理，不投喂任何药物，完全为四氯化碳(CCL4)急性肝损伤个体；(3)阳性组，肝损伤处理，投喂护肝片，0.4 g/kg；(4)高剂量组，肝损伤处理，投喂高剂量蓝狐胆汁粉，10 g/kg；(5)低剂量组，肝损伤处理，投喂低剂量的蓝狐胆汁粉，5 g/kg。首先用TLC法研究蓝狐胆汁成分中是否含有熊胆特有成分——牛磺熊去氧胆酸(UDCA)，其次研究其胆汁对小鼠CCL4肝损伤是否有保护作用。结果 对比蓝狐胆汁与熊胆汁，两者的相似度约50%， 两者共四类物质中，有两类相同，蓝狐胆汁中含有UDCA成分。实验动物的肝脏被CCL4损伤之后，血清中的AST、ALT浓度明显增高，模型组与空白组对比，差异有统计学意义(P<0.05)。通过药理结果及病理切片，可以看到具有抑制CCL4，造成急性肝损伤小鼠AST、ALT浓度降低的作用。结论 蓝狐胆汁对损伤的肝细胞有修复意义，对肝脏有明显的保护作用。

蓝狐胆汁；谷草转氨酶；谷丙转氨酶；四氯化碳肝损伤

蓝狐，食肉目(carnivora)犬科(canidae)狐属(vulpes)的珍贵毛皮动物，是人工繁育一个世纪后的北极狐(alopex lagopus)后代[1]。蓝狐胆囊在民间具有特有的药用价值，《四川中药志》中提及其胆“风干研细，兑开水服，治心气痛”[2]。由于考虑蓝狐与熊类亲缘关系近，同为食肉目，其食性相似，投喂饲料的种类相似，因此本研究首先利用薄层色谱法(TLC)，研究蓝狐胆汁成分中是否含有熊胆特有成分——牛磺熊去氧胆酸(UDCA)；其次考察它对小鼠CCL4肝损伤是否有保护作用，旨在确定蓝狐胆汁的药理作用。

1 材料与方法

1.1 材料 蓝狐胆取自黑龙江省绥化狐狸养殖场。将打皮后的蓝狐尸体30只进行解剖，取出胆囊，提取胆汁，37 ℃烘干48 h，获得蓝狐胆汁干粉；取清洁级昆明种小鼠30只(浙江中医药大学实验动物研究中心提供，使用许可证：SYXK [浙]2013-0184)，体重18～22 g，雌雄各半。

1.2 仪器与设备

1.2.1 TLC分析 熊胆标准品、熊去氧胆酸(UDCA)标准品由中国药品生物制品检定所提供，薄层层析硅胶(青岛海洋化工有限公司)、NaOH溶液、甲苯、盐酸、氯仿、甲醇、丙酮由天津市凯通化学试剂有限公司提供。TLC分析仪器主要包括：显微镜、薄层层析玻璃板、层析缸、玻璃点样毛细管、分析天平、容量瓶、蒸发皿、量杯、烘干箱等。

1.2.2 CCL4肝损伤 丙氨酸氨基转移酶试剂盒、草氨酸氨基转移酶试剂盒、丙二醛试剂盒、总胆固醇试剂盒由上海源叶生物科技有限公司提供。CCL4分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，D-氨基半乳糖盐酸盐(美国Sigma公司)，生理盐水(浙江药业有限公司)，鲁花花生油(山东魯花集团有限公司)，4%甲醛溶液，70%乙醇，护肝片、蒸馏水等。实验中所用两种致肝损伤药物为CCL4溶液，豆油稀释，配比浓度为20%；D-Galn溶液，生理盐水稀释，配比浓度为10%。抗肝损伤药物两种，护肝片(葵花药业股份有限公司，国药准字Z20003336)，主要成分包括猪胆粉、柴胡、茵陈、板蓝根、五味子和绿豆。蓝狐胆汁粉备用。

实验仪器包括全自动生化分析仪(Glamour2000，法国)、轮转式切片机(LeicaRW2235，德国莱卡公司)、分光光度计(722型，浙江高密仪器厂)、投射电子显微镜(荷兰飞利浦公司)、光学显微镜(Nikon)、离心机(浙江高密仪器厂)、水浴锅(上海医用分析仪器厂)、电子匀浆机(上海医用分析仪器厂)、自动染色仪(LeicaAutoStainerXL，德国莱卡公司)、酶标仪(美国热电公司)、石蜡包埋机(LeicaEG1160)、烤箱等。

1.3 方法

1.3.1 TLC分析 (1)样品制备：取精密测定蓝狐胆汁粉末50 mg，加8%的NaOH溶液5 ml，120 ℃热水超声溶解2 h，滴加盐酸调节pH至2～3。再用甲醇超声提取2次，每次加10 ml，30 min合并提取液，置水浴上蒸发至干[4]。残渣加甲醇适量溶解，移至5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。(2)对照品制备:取熊胆标准品、UDCA标准品各5 mg，置1 ml量瓶中。加甲醇溶液，备用。(3)试剂配制:将浓度为80%的NaOH加生理盐水至10 ml，配制成8%的NaOH溶液。将2 ml浓盐酸加生理盐水至10 ml，配制成稀盐酸。将1.25 g磷钼酸加无水乙醇至25 ml，制成磷钼酸乙醇。

1.3.2 实验分组及CCL4肝损伤处理 取30只昆明种小鼠，分为5组，每组6只。分别为：(1)空白组，非肝损伤处理，投喂蒸馏水，注射无伤害性的豆油；(2)模型组，肝损伤处理，不投喂任何药物，完全为CCL4急性肝损伤个体；(3)阳性组，肝损伤处理，投喂护肝片，0.4 g/kg；(4)高剂量组，肝损伤处理，投喂高剂量蓝狐胆汁粉，10 g/kg；(5)低剂量组，肝损伤处理，投喂低剂量的蓝狐胆汁粉，5 g/kg。

肝损伤处理之前，喂药物的3组分别灌胃给药， 1次/d，连续10 d。空白组只投喂同体积的蒸馏水。最后一次给药前16 h，各组做肝损伤处理。在动物腹腔注射CCL4豆油溶液，2 ml/kg。空白组只注射同体积的豆油。肝损伤处理后，动物禁食禁水。末次给药后1 h，将动物断头取血，离心，取血清，测定血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)浓度。

1.3.3 肝组织切片染色方法 将实验动物的肝组织在4% 甲醛溶液中固定24 h，自来水冲洗6 h，用70% 的乙醇浸泡备用。自动脱水机脱水后，用石蜡包埋机包埋，制成组织蜡块，再用切片机切片，55 ℃烤箱内过夜。充分烘干后，用自动染色仪水化，HE染色，中性树胶封片，数字显微照相机观察肝小叶机构和细胞形态，做病理学检查，并拍摄照片。

2 结 果

2.1 TLC分析结果 图1显示，蓝狐胆汁中明显存在3类物质(A、B、C)，其迁移值Rf分别为A=9.5，B=8.0，C=6.5。熊胆汁中也存在3类物质(E、F、G)，其迁移值Rf分别为E=9.5，F=8.0，G=7.4。对比蓝狐胆汁与熊胆汁，两者的相似度约50%，即两者共四类物质中，有两类相同。使用UDCA标准品所做的TLC图谱发现，该物质(D)的Rf值为D=8.0，说明蓝狐胆汁与熊胆汁均存在相同的UDCA。

图1 蓝狐胆汁与熊胆汁TLC图谱

2.2 蓝狐胆汁对CCL4肝损伤的影响

2.2.1 对CCL4肝损伤血清ALT、AST浓度的影响 实验动物肝被CCL4损伤后，血清AST、ALT浓度明显增高(表1)，模型组与空白组对比，差异有统计学意义(P<0.05)；阳性组(投喂护肝片的个体)与模型组之间AST、ALT指标相比，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 蓝狐胆汁对CCL4急性肝损伤血清AST、ALT活力的影响 (n=6；

注：与模型组相比，①P<0.05；与空白组相比，②P<0.05

2.2.2 组织病理切片 (1)空白组：肝结构正常，肝小叶中央静脉清晰，肝细胞形态未见异常，胞浆丰富。嗜酸红染，胞核染成蓝色，肝窦清晰可见，小叶内未见炎性反应细胞浸润(图2A)。(2)模型组：肝细胞变性明显，大量肝细胞胞浆疏松化，甚至气球样变。可见肝细胞点状坏死，坏死区有炎性反应细胞浸润，标志着肝组织已经受到损伤(图2B)。(3)阳性组：肝组织已基本恢复，但仍可见肝细胞轻度水肿(图2C)。(4)高剂量组：肝细胞仍可见水肿，但未见明显的炎性反应细胞浸润(图2D)。(5)低剂量组：肝细胞有明显水肿，偶见肝细胞点状坏死(图2E)。

图2 正常小鼠与CCL4急性肝损伤小鼠病理(HE,×400)

3 讨 论

CCL4作为导致肝损伤的物质，其致病机制比较复杂，与氧化应激和脂质过氧化等有关[6]。氧化应激反应能生成醛类等副产物，如丙二醛MDA等，它们能与细胞内的蛋白质和DNA结合，最后使细胞受损。脂质过氧化反应的代谢产物是三氯甲基自由基及过氧化三氯甲基自由基，它们能刺激生成Kupffer细胞，释放促炎性反应因子，使细胞内的转氨酶AST和ALT溢出，并诱发结石。肝损伤时ALT会首先进入到血液，而当线粒体损伤严重时，AST则大量进入血清。如果这两种物质超过正常值的2倍，且持续2周左右，就可以判断为肝损伤。本研究结果表明，CCL4使小鼠血清AST和ALT浓度上升，意味着小鼠肝已经受到比较严重的伤害。

本研究结果表明，蓝狐胆汁对肝损伤的确具有治疗作用。虽然蓝狐胆汁中有多种成分，但游离型胆汁酸UDCA应该是蓝狐胆汁的主要药性成分。因为自1961年日本学者首次证实UDCA是熊胆中治疗肝损伤的药性物质以来[3]，人们多次通过实践证明，UDCA类物质为治疗各种肝损伤的特效药物[3，4]。本研究采用的护肝片是阳性临床复方中药，功能主要是疏肝理气、健脾消食、降低转氨酶(能使AST下降80.67%，使ALT降低70.37%)，被广泛用于脂肪肝、乙醇肝、药物性肝损伤、早期肝硬化等症的治疗。值得注意的是，在其药用成分(熊胆或猪胆粉20 g，柴胡250 g，茵陈250 g，板蓝根250 g，五味子250 g，绿豆128 g)中熊胆粉重量只占1.7%[5]，足见UDCA类物质的药性作用较大。

按照以往建模经验[7-10]，小鼠腹腔注射20%～50%浓度的CCL4植物油溶液，并按2 ml/kg的剂量，建模效果是最好的，AST和ALT数值能成倍增加。注射20%浓度的CCL4组，病理切片出现肝损伤典型现象(肝细胞明显疏松化、气球样变、炎性反应细胞浸润、点状或块状坏死)；注射50%浓度的CCL4组，病理切片除了经典现象，还伴有肝纤维化改变。本研究选用20%浓度建模的结果是成功的，能够满足实验的要求，空白组与模型组差异有统计学意义(P<0.05)，病理切片变化明显。

综上所述，蓝狐胆汁中含有熊胆有效成分UDCA，无论是高剂量还是低剂量，投喂蓝狐胆汁粉的肝受伤小鼠，血液中的AST、ALT浓度均出现明显下降，说明蓝狐胆汁具有很强的护肝作用。

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(2015-03-03收稿 2015-05-20修回)

(责任编辑 郭 青)

Economy class animal blue fox bile for TLC identification and its protection against CCL4hepatic injury

ZHOU Bo1, JIA Jingbo2, and LI Jiaming3.

1.College of Wildlife Resource, Northeast Forestry University, Harbin 150050,China;2.Traditional Chinese Medicine Resources Development and Utilization, College of Pharmacy Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150001,China; 3.Department of Orthopedics the Fifth Hospital in Harbin City of Heilongjiang, Harbin 150051,China

Objective To determine the pharmacological effects of blue fox bile. Method Thirty Kunming mice were divided into 5 groups, each group of six. (1)For the blank group, without the liver damage treatment, was fed on distilled water, and harmless soybean oil was injected. (2) For the model group with liver damage, no drugs were given, were completely CCL4acute liver injury individuals. (3) For positive group with liver damage were fed on liver-protecting, 0.4/kg. (4) For the high dose group with liver damage was fed on high dose of blue fox bile powder, 10 g/kg. (5) For the low dose group with liver damage was fed on the low dose of blue fox bile powder, 5 g/kg. The first study was using TLC method, to determine whether the blue fox bile contained ursodeoxy cholic acid (UDCA). The second study was to determine whether the blue fox bile has a protective effect on CCL4caused hepatic injury in mice. Results The similarity between blue fox bile and bear bile is about 50%, both with two kinds of material, the same in the four kinds of material. Blue fox UDCA component is contained in bile. After experimental animals were inflicted on injury of the liver by CCL4, AST and ALT in serum concentration significantly increased; the difference between the model group and the blank group was statistically significant. Through pharmacological results and pharmacological slices, it can be seen that CCL4caused AST, ALT concentration effect acute liver injury can be inhibited in mice. Conclusions Blue fox bile can repair injury of liver cells and has obvious protective effects on the liver.

blue fox bile; AST; ALT; CCL4liver damage

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531656)

周 博，博士，讲师，E-mail：251461104@qq.com

1.150050 哈尔滨，黑龙江中医药大学药学院；2.150001 哈尔滨，东北林业大学野生动物资源学院；3.150051，哈尔滨市第五医院

贾竞波，E-mail:Jiajingbo2011@163.com

R961.1