直线加速器X线照射对人肺成纤维细胞经典Wnt通路中关键信号蛋白的影响

祝 艳，张春阳，冯华松,陈旭昕，王 伟

直线加速器X线照射对人肺成纤维细胞经典Wnt通路中关键信号蛋白的影响

祝 艳1，张春阳2，冯华松2,陈旭昕2，王 伟3

目的 探讨直线加速器X线照射对人肺成纤维细胞经典Wnt通路中关键信号蛋白的影响。方法 人肺成纤维细胞分为照射组和正常对照组，照射组经直线加速器X线5 Gy照射24 h后，Western blot检测两组成纤维细胞胞核内β-catenin蛋白表达，Real time PCR检测成纤维细胞胞核内β-catenin mRNA表达，ELISA法检测细胞培养液中WISP-1蛋白表达。结果 照射组人肺成纤维细胞β-catenin蛋白表达和mRNA表达水平均高于对照组，WISP-1蛋白表达水平也显著升高，与对照组比较均有统计学意义[(637±88)vs(387±58)，P<0.05]。结论 直线加速器X线照射可诱导人肺成纤维细胞经典Wnt通路活化，促进肺纤维化的形成，可能为放射性肺损伤的治疗提供新的靶点。

放射性肺损伤；Wnt信号通路；肺成纤维细胞；肺纤维化；直线加速器

放射性肺损伤是胸部恶性肿瘤进行放射治疗中常见的不良反应之一，可进展为肺间质纤维化，严重影响患者的生活质量，限制了放射治疗的开展[1,2]。此外，核泄漏事故的频发和战争中核武器的使用所造成的辐射效应也可累及肺部。文献[3]报道Wnt信号通路是肺组织发育所必需的分子信息传递系统，在细胞的增殖及分化过程中起到重要作用，其表达异常与肺纤维化和肺部肿瘤等呼吸系统疾病都存在紧密的联系。本研究通过检测放射线照射后人肺成纤维细胞(human lung fibroblasts，HLFs)中经典Wnt通路中部分主要信号蛋白的变化，以揭示放射线对其影响，为探索放射治疗致肺损伤的新靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 HLFs由解放军医学院陈洁博士惠赠； DMEM/F12培养液、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS;GIBCO，USA)，按培养液∶胎牛血清为9∶1的比例配置成完全培养液；青霉素、链霉素、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Hyclone，USA)、5%牛血清白蛋白、PMSF、磷酸酶抑制药、β-catenin 兔单克隆一抗(1∶500，EPITOMICS,1247-1)、GAPDH 兔单克隆一抗(1∶500，abcam, ab9485)、Histon H3 兔多克隆一抗(1∶500，abcam, ab45173)、HRP标记羊抗兔IgG二抗(1∶1000，Jackson，购自北京普利莱生物技术公司，货号：C1309)、胞核胞浆蛋白制备试剂盒 (Nuclear-Cytosol Extraction Kit，P1200，APPLYGEN)、反转录试剂盒(Prime ScriptTM RT Reagent Kit，RR037A，Takara)及荧光定量PCR试剂盒(SYBR® Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus) Kit, RR820A/B，Takara)购自宝生物(大连)有限公司；TRIzd WISP-1(BP-E11700, Lengton)ELISA试剂盒、ELISA酶标仪(Thermo，3001-122J)、二氧化碳培养箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 HLFs的培养 将细胞接种于含10%FBS的DMEM/F12中，放于37 ℃ 5% CO2的培养箱内，每1～2 d换液1次，待细胞融合至80%左右传代。

1.2.2 分组 HLFs传代24 h后，细胞贴壁，分为对照组(C组)和照射组(R组)。C组常规培养，不做任何处理；R组细胞经X线照射(剂量为5 Gy)。两组细胞再培养24 h后分别留取上清、提取细胞核蛋白和RNA。

1.2.3 检测方法及指标

1.2.3.1 Western Blot 检测HLFs中β-catenin的蛋白表达 按实验条件分组处理后，收集细胞，预冷PBS洗涤2 次，加入200 ml胞核蛋白提取裂解液(每1ml裂解液中加10 μl PMSF)，冰上裂解10 min，摇床震荡。4 ℃，12 000 r/min，离心10 min，取上清,BCA法测定蛋白含量。4∶1体积比加入上样缓冲液，100 ℃ 5min 蛋白变性。每孔上样等量总蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后取下凝胶，30 V转膜150 min，含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h。TBST 洗膜5 min/次×3 次，加入一抗β-catenin(1∶1000 稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜3 次,每次5 min，加入对应二抗(1∶500稀释)，室温孵育1 h。显色液暗处显色观察，凝胶成像系统扫描分析，β-catenin水平用β-catenin和内参蛋白的相对密度表示。

1.2.3.2 实时荧光定量-PCR检测HLFs中β-catenin基因mRNA表达水平 将收集的HLFs加入500 μl TRIzol试剂抽提细胞总RNA，测定总RNA纯度及浓度。使用反转录试剂盒反转录合成cDNA，反应体系：5×Mix 2 μl，RNA 8 μl，总量10 μl；反应条件，37 ℃，15 min；85℃，5 s。反转录产物采用real

time PCR试剂盒进行PCR扩增，反应体系20μl：2×SYBR Mix 10μl，上下游引物各0.4 μl，ROX Dye 0.4 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 6.8 μl。采用ABI step one plus序列检测系统进行PCR扩增，反应条件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，35个循环。以β-actin为内参校正每个样本的循环阈值Ct，得到ΔCt，目的基因的相对表达量以2-ΔΔCt值表示，重复3次。引物设计及合成由上海生工生物工程有限公司完成:β-catenin sense 5′-CTTACACCCACCATCCCACT-3′；antisense 5′-GCACGAACAAGCAACTGAAC-3′。β-actin sense 5′- TGCGTGACATTAAGGAGAA-3′；antisense 5′-TGATGGAGTTGAAGGTAGTT-3′。

1.2.3.3 ELISA检测细胞培养液上清中WISP-1水平 采用ELISA法(试剂盒)，ELISA酶标仪在450 nm处测吸光度值，参照标准曲线计算其浓度值，每个样本做3复孔。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。数据符合正态分布，两组均数比较采用成组t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 倒置相差显微镜下观察HLFs的形态 HLFs传代后正常培养48 h后，于倒置相关显微镜不同倍镜下观察细胞形态(图1)，细胞大小基本一致，细胞形态呈梭形、三角形或不规则形，边缘光滑，细胞排列为旋涡状或放射状。

图1 倒置相差显微镜不同倍镜下HLFs细胞形态

2.2 Western blot检测结果 β-catenin表达显示定位于HLFs细胞核内。C组β-catenin蛋白表达较弱，照射后HLFs细胞核内β-catenin蛋白表达明显增强(图2)。

图2 Western blot 检测HLFs胞核中β-catenin蛋白表达

2.3 Realtime PCR 检测HLFs β-catenin mRNA水平 R组中24 h HLFs中β-catenin mRNA表达水平是正常HLFs的(10.4±2.2)倍，差异有统计学意义(P=0.0016)。

2.4 ELISA检测细胞培养液中WISP-1表达 C组为387±58，R组为637±88,R组明显高于C组，差异有统计学意义(P<0.01),提示放射线照射后的HLFs产生WISP-1增多。

3 讨 论

放射性肺纤维化是放射性肺损伤的演变和结局，以至使广大患者感到恐慌，其预防和治疗迫在眉睫。肺纤维化过程中有多种细胞因子共同参与，形成复杂的细胞因子网络，通过影响间质成纤维细胞和肺泡上皮细胞的增殖和凋亡，促使肺纤维化持续进展。肺成纤维细胞被认为是纤维化诱导形成和发展过程中的主要细胞类型，其活化、增殖和分化，以及随之出现的大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的沉积是肺纤维化的重要标志[4,5]。

近年来多项研究表明，Wnt信号途径参与肺纤维化的形成过程[6,7]。Wnt信号通路是一条高度保守的信号传导途径，通过调控细胞形态与功能的分化、细胞凋亡与细胞癌变等，影响着生命过程。Wnt通路包括以下3条途径：(1)经典Wnt信号途径，即Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号途径，调控细胞的增生和分化；(2)平面细胞的极性(the planar cell polarity，PCP)途径，即Wnt/PCP途径，在脊椎动物中又称Wnt/JUN激酶途径；(3)Wnt/Ca2+途径[8,9]。其中经典Wnt信号通路，即Wnt/β-catenin信号转导系统作为肺部发育所必需的分子信息传递系统，其表达异常与肺纤维化也密切相关，引起众多学者的广泛研究。该通路表达如下：当Wnt蛋白与细胞表面卷曲蛋白受体(Fzzled，Fz)以及辅助受体LRP5/6(低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6)结合，Wnt信号通路被激活，活化的蓬乱蛋白(Dishevelled，Dsh或Dvl)抑制糖原合成酶3β(GSK-3β)活性，从而β-catenin磷酸化减少，导致β-catenin不能被泛素连接酶识别，从而不能被蛋白酶复合体降解，β-catenin在胞质内大量积累，并向核内转移，与核内含有高迁移组非组蛋白盒(HMG—BOX)的转录因子T细胞因子/淋巴细胞增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，Tcf/LEF)家族成员结合，启动下游靶基因的转录。相关研究表明，当β-catenin在细胞核内聚集时，可作为该信号通路激活的标志[10]。Jésus等[11]在呼吸机相关性肺损伤(Ven- tilator Induced Lung Injury，VILI)的研究中认为，Wnt5a、β-catenin激活下游靶基因中基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7，MMP7)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轴蛋白AXIN2，在VILI早期即可引起肺纤维化。另有研究通过基因重组方法，使人胚肺成纤维细胞高表达β-catenin，发现可降低上皮型钙黏连素的表达和细胞间黏附，促进细胞趋化，由此认为β-catenin在肺纤维化的发生中起推动作用[12]。Chilosi等[13]对特发性肺纤维化的研究中发现，在胞核内β-catenin水平增加的同时，Wnt信号通路下游靶基因cyctin D1和MMP基因转录也随之增强，这可能是成纤维细胞异常增殖的原因之一。此外，Wnt通路与多个信号途径,如Smad途径有交叉对话，通过β-catenin影响转化生长因子β(TGF-β)的转录活性，促使肺泡上皮细胞向成肌纤维样细胞转化，增加细胞外基质的堆积；TGF-β亦可正向调节Wnt通路，与肺纤维化的发生密切相关[14,15]。本实验通过模拟体内环境，将HLFs直接暴露在直线加速器X线下，照射剂量5 Gy[16,17],体外检测Wnt信号通路中的关键信号表达。研究发现照射组β-catenin蛋白水平较对照组明显高表达，证实经放射线照射刺激后，Wnt/β-catenin信号通路被激活。因此β-catenin被视作Wnt信号通路中的关键信号因子，在肺纤维化的各个环节扮演着重要角色，有望成为调控Wnt信号通路和干预肺纤维化过程的靶点。

此外，研究发现细胞培养液中WISP-1表达升高。WISP-1是Wnt/β-catenin信号通路的下游基因之一，是一种富含半胱氨酸的长度为367个氨基酸的分泌性蛋白多肽，可由成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等多种细胞合成分泌[18]。有研究表明，WISP-1在肺纤维过程中出现过表达[19]。同时，在体内试验中抑制WISP-1可减轻实验性肺纤维化[20]。WISP-1表达的变化表明与肺纤维化密切相关。本研究发现，当Wnt/β-catenin通路活化后，其下游的靶基因WISP-1表达明显升高，提示放射线照射活化该通路后导致HLFs产生WISP-1显著增加，从而促进的纤维化的形成。就此推测WlSP-1可能是抗肺纤维化治疗的又一潜在靶点，为纤维化疾病的治疗提供了新视角。

本研究表明，HLFs经放射线照射后高表达β-catenin、WISP-1，提示放射线可激活HLFs中经典Wnt信号通路，且该通路下游可过表达靶基因WISP-1。目前发现该通路中的主要组分均在放射性肺纤维化发生发展中扮演重要角色[21,22]。本研究证实，作为放射性肺损伤中的重要效应细胞，HLFs在放射线照射后，有可能通过活化该通路参与到放射性肺损伤的过程。因此，通过抑制Wnt/β-catenin通路中的关键因子可能会达到阻滞纤维化进展的目的，为今后临床上靶向治疗肺纤维化提供方向和思路。此外，由于传统治疗肺纤维化的方法局限，收效甚微，关于干细胞治疗肺纤维化的研究已经广泛展开，且已有研究表明间充质干细胞可以修复肺泡上皮细胞和抑制纤维增生[23,24]，延缓肺纤维化的进展，其治疗机制尚未完全阐明。因此，对于干细胞是否通过抑制HLFs中经典Wnt信号通路，从而影响肺纤维化的发生发展是笔者课题组目前正在研究的内容。本实验仅仅在体外单一细胞水平研究了放射线对纤维化的影响，尚需更多动物实验和临床试验进一步证实，为临床治疗肺纤维化奠定基础。

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(2015-01-14收稿 2015-02-28修回)

(责任编辑 梁秋野)

Effect of X-ray linear accelerator on the signaling proteins of canonical Wnt pathway in human lung fibroblasts

ZHU Yan1,ZHANG Chunyang2, FENG Huasong2,CHEN Xuxin2,and WANG Wei3.

1.Navy Clinical Academy,Anhui Medical Uiniversity,Hefei 230032,China;2.Respiratory Diseases Department,3.Radiation Oncology, Navy General Hospital,Beijing 100048,China

Objective To investigate the effect of irradiation with X-ray linear accelerator on the key signaling proteins of canonical Wnt pathway in human lung fibroblasts (HLFs). Methods HLFs were divided into irradiated group and normal group. R group was irradiated by linear accelerators X-ray(5 Gy). After 24 hours, the expression of the protein levels of β-catenin in nucleus was examined by Western blot, the mRNA level of the HLFs was examined by real time PCR,and the levels of WISP-1 protein in conditioned medium (CM) was examined by ELISA. Results Compared with the normal control group, the protein and gene expression level of beta-catenin increased in irradiated group HLFs,the same to the protein expression levels of WISP-1，which were statistically significant(P<0.05).Conclusion Irradiation with X-ray linear accelerator can induce the activation of canonical Wnt signaling pathway in HLFs and promote the formation of pulmonary fibrosis,which probably provide the new target of the treatment of radiation-induced lung injury.

radiation-induced lung injury; Wnt signaling pathway; lung fibroblasts; pulmonary fibrosis;linear accelerator

基金支持：国家自然科学基金资助项目(81300050)

祝 艳，硕士研究生，E-mail：zhuyan890925@126.com

1.230032 合肥，安徽医科大学海军临床学院；100048 北京，海军总医院：2.呼吸内科，3.放射肿瘤科

冯华松，E-mail：fenghs99@163.com

R818.02