星点设计-效应面法优化葛根黄酮固体脂质纳米粒处方

张广远，孙士淋，刘昕，樊红波，王玉，管清香

(吉林大学药学院，长春 130021)

现代药理研究表明，葛根黄酮有降低血管阻力、改善心脑血液循环、降低心肌耗氧量等多种药理作用，但其难溶于水，生物利用度低，限制了临床应用[1]。固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticle，SLN)为20世纪90年代初发展起来的新型微粒给药系统，近年来已受到越来越多的关注，尤其针对水难溶性药物。与其他微粒给药系统相比，SLN不仅可提高药物生物利用度，还具有控制释放、靶向作用等优点[2]。为了提高葛根黄酮的口服生物利用度，我们制备了葛根黄酮固体脂质纳米粒(Puerarin flavonoids solid lipid nanoparticle，PF-SLN)，其平均粒径为(263.82±3.6)nm，体外释放缓慢，符合Higuchi方程[3]。大鼠体内药动力学研究结果表明，PF-SLN可显著提高葛根黄酮的口服生物利用度，其相对生物利用度为PF混悬液的2.73倍[4]。星点设计(Central composite design，CCD)和效应面(Response surface)优化法是一种常用的实验优化方法，预测性较好[5]，本试验主要采用星点设计-效应面法筛化PF-SLN的最佳处方。

1 仪器与试药

LC-10AT型高效液相色谱仪、SPD-10A型紫外检测器(日本岛津公司)；UNIC2100型紫外分光光度计(上海天普分析仪器有限公司)；TGL-16G型低温超速离心机(德国艾本德股份公司)；90-3型恒温磁力双向搅拌器(上海振荣科学仪器有限公司)。

葛根黄酮(西安赛邦医药科技有限公司，纯度66.7%)；葛根素对照品(北京生物制品检定所)；泊洛沙姆188(德国BASF公司)；硬脂酸(天津市光复精细化工研究所)；注射级大豆卵磷脂(上海爱康精心化工有限公司)；其它试剂为分析纯。

2 方法

2.1 固体脂质纳米粒的制备

取处方量泊洛沙姆188溶于适量水中，(75±2)℃恒温搅拌溶解，作为水相；处方量的葛根黄酮、卵磷脂和硬脂酸溶于适量乙醇中，作为有机相。在恒速搅拌下，将有机相以恒定速度注入至水相，继续恒温搅拌30min后，浓缩至40mL，并迅速加入一定体积(0～2)℃的水相中，继续搅拌60min，即得PF-SLN混悬液。

2.2 色谱条件

C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相甲醇-水(40∶60)；流速1.0mL/min；检测波长250nm；柱温22℃；进样量20μL。

2.3 包封率的测定

取PF-SLN混悬液，12 000r/min离心30min，取上清液，经0.45μm滤膜滤过。精密量取续滤液1mL，甲醇定容至5mL，混匀。按“2.2”项下色谱条件测定，样品平行实验3次。

2.4 星点设计-效应面法优化纳米粒处方

根据预试验，确定脂质硬脂酸(X1，g)、乳化剂大豆卵磷脂(X2，g)及泊洛沙姆188(X3，g)的用量对纳米粒包封率(Y)影响较大。以这3种辅料用量为考察对象，根据预实验设定因素水平(表1)。

表1CCD因素水平表

Table1IndependentvariablesandlevelsofCCD

因 素Factors水 平 Levels-1.732-1011.732X10.32680.4000.5000.6000.6732X20.05670.0750.1000.1250.1433X30.12680.2000.3000.4000.4732

3 结果与讨论

3.1 方法学考察

3.1.1专属性考察按“2.2”项下色谱条件，分别将葛根素标准品溶液(A)、空白SLN离心滤液(B)及PF-SLN离心滤液(C)分别进样。结果，辅料不干扰葛根素的测定(图1)。

3.1.2标准曲线的绘制精密吸取葛根素对照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，分别进样。以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归，得回归方程为：Y=13 091X+6249.2(R2=0.9999)。结果可见，在实验范围内，峰面积与浓度具有良好的线性关系。

3.1.3精密度试验精密吸取葛根素对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件，连续进样5次，记录峰面积。计算RSD值为0.94%。

3.1.4回收率试验精密量取PF-SLN供试液(葛根素含量为2.13μg/mL)，精密加入葛根素对照品溶液，分别配制成低浓度(0.12μg/mL)、中浓度(2.42μg/mL)、高浓度(4.86μg/mL)溶液。进样测定，求得平均回收率为98.52%，RSD为0.77%。

3.2 星点设计结果及处方优化

以脂质硬脂酸(X1，g)、乳化剂大豆卵磷脂(X2，g)及泊洛沙姆188(X3，g)为自变量，考察其用量对包封率(Y，%)的影响，按“2.1”项下方法制备纳米粒，测定包封率(表2)。

采用SPSS 13统计软件，分别对各因素进行多元线性回归，得回归方程：Y=0.296+0.282X1+0.526X2+0.091X3(R2=0.662，P=0.023)，相关性较差。删除P>0.2项，二项式方程重新拟合，得回归方程为：Y=-0.451+3.06X1-0.122X2+0.868X3+3.5X1X2-0.525X1X3+1.600X2X3-2.975X12-7.873X22-1.125X32(R2=0.952，P=0.001)，因变量和自变量相关性较好。根据回归方程可知，因素X1、X2、X3对包封率均有影响，其中因素X1对包封率的影响较为显著，X3其次。根据拟合方程，以Origin 7.0软件绘制包封率与各因素间的三维效应面曲线图(图2)。

表2星点设计与结果

Table 2 CCD experiments and results

图2 包封率Y和各因素的三维效应面

由图2可见，X1与X2，X1与X3对包封率的影响存在交互作用。各因素最佳范围分别为：X1=0.50g～0.65g，X2=0.125g～0.14g，X3=0.25g～0.45g。综合考虑，确定3因素的最佳验证工艺参数分别为：X1=0.50g，X2=0.13g，X3=0.35g。制备3批PF-SLN，测得平均包封率为(67.53±0.12)%。二项式方程的预测值为71.0%，二者偏差小于5%。结果表明，实验所得的拟合方程可较

好预测实验结果。

3.3 辅料对纳米粒影响

研究中发现，硬脂酸及泊洛沙姆188的用量可直接影响纳米粒混悬液的稳定性。硬脂酸用量过多时，纳米粒混悬液短时间内出现沉降现象。用量较少时，一定程度上可增加纳米混悬液的稳定性，但包封率也随之降低。一定程度上，泊洛沙姆188的加入可改善纳米粒混悬液的稳定性。卵磷脂的加入量过多也可致包封率下降，可能与过量卵磷脂形成胶束有关。

星点设计联合效应面优化法可设计出较为理想的实验方案，可在今后的实验过程中推广使用。

[1]徐轶尔,李秋红,杨菲菲,等.中药葛根的药理药效研究[J].吉林中医药,2010,30(11):993-994.

[2]Kocbek P,Baumgartner S,Kristl J,et al.Preparation and evaluation of nanosuspensions for enhancing the dissolution of poorly soluble drugs[J].International Journal of Pharmaceutics,2006,312(1-2):179-186.

[3]管清香,朱琨,林天慕,等.可生物降解固体脂质纳米粒的制备、表征及药物的体外释放[J].高等学校化学学报,2010,31(11):2298-2302.

[4]Guan QX,Guan QT,Lin TM,et al.Preparation and pharmacokinetics of solid lipid nanoparticles loaded with pueraria flavones[J].Journal of Control Release,2011,152:25-26.

[5]黄小丽,杨美燕,王玉丽,等.星点设计-效应面法优化托吡酯缓释微丸处方[J].国际药学研究杂志,2013,40(2):242-247.