吸收促进剂对人参糖蛋白肠道吸收的影响

陈英红，王颖，姜翔之，罗浩铭

(1．吉林省中医药科学院，长春 130012； 2．吉林大学中日联谊医院，长春 130021；3．长春中医药大学，长春 130117)

人参为名贵中药材，在中国应用人参防治各种疾病已有几千年的历史，人参的主要成分人参皂苷的化学及生物活性方面的研究很多。近年研究表明，人参糖蛋白具有明显的镇痛作用[1]，这一发现为开发利用人参药材提供了新的途径。

由于糖蛋白多是亲水性的生物大分子，在胃肠道环境下稳定性差，易被胃酸和胃蛋白酶等降解，同时，由于其亲水性，无法穿透小肠黏液层和上皮层组成的胞间紧密连接等生理屏障[2]。因此，如何提高糖蛋白类化合物口服吸收的生物利用度一直是医药学界开发新药需要解决的瓶颈。吸收促进剂是一类能提高胃肠道对蛋白多肽等药物的吸收、使药物穿过肠道的生理屏障进入系统循环、进而到达靶位点发挥药效、提高药物口服生物利用度的化合物[3]。离体肠段模型常用于考察促进剂作用的部位差异及促进剂的筛选[4]。本研究选择了几种不同作用机制的吸收促进剂，以探讨不同吸收促进剂对人参糖蛋白(PGG)在肠道吸收的促进作用，为PGG肠道吸收机制研究奠定基础，同时也为PGG新型口服制剂进一步开发提供新的思路。

1 仪器与试药

1.1 仪器

960MC型荧光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；体外透膜装置(吉林省中医药科学院仪器室)。

1.2 试剂

癸酸钠、十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)(Sigma公司)；去氧胆酸钠(SDCh，北京市海淀区微生物培养及制品厂)；水溶性壳聚糖(脱乙酰度50%，青岛海汇公司)；卵磷脂(上海浦江磷脂有限公司)。

1.3 动物

Sprague-Dawley(SD)大鼠(♂，100只，体重250g～300g，吉林大学医学院实验动物部提供)。

2 实验方法

2.1 肠囊处理

SD大鼠称重，腹腔注射乌拉坦1.0g/kg，麻醉后背位固定于手术台板上，沿腹中线剪开腹部，按以下方法分离并剪取各肠段8cm：十二指肠自幽门2cm处开始；空肠自十二指肠空肠曲下2cm处开始；回肠离盲肠上行2cm处开始；结肠段从盲肠后段1cm处开始。用氧气饱和并预冷的台氏液冲洗各肠段表面及肠道内容物，剪去浆膜侧的脂肪组织，备用。

2.2 供试液配制

用台氏液分别配制1%卵磷脂、1%十二烷基硫酸钠、1%癸酸钠、1%去氧胆酸钠和1%水溶性壳聚糖各促进剂溶液。用促进剂溶液配制供试品溶液40mg/mL。

2.3 体外透膜实验

参照沈腾等[5]所设计的离体实验模型，并略作改动。实验时，截取约3cm长的肠囊两端，分别用细线系紧，注入0.2mL供试液后将肠囊置于预先加有20mL台氏液37℃预热的夹层凹槽中(凹槽内径和高度分别为2cm和12cm，外接恒温水浴，内置搅拌子)，肠囊内、外侧通过毛细管供氧混合气(O2∶CO2=95∶5)，开动搅拌器使系统平衡10min后计时，于30min、60min、90min、120min取样0.2mL，同时补充等量同温的台氏液。每次实验后测定肠囊的表面积。

2.4 测定法

配制0.154mg/mL的PGG供试品溶液，分别取供试品溶液0.05mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1mL、2mL，加台氏液至10mL，在505nm处测定荧光吸收值。灵敏度：2，空白台氏液A=0.3。以供试品溶液浓度对吸收值制作标准曲线，得回归方程：Y=0.072+294.186X，r=0.9989。每隔一定时间取外液0.2mL，加台氏液稀释至3mL，测定505nm处荧光吸收值A。代入回归方程计算透出液浓度，除以样品浓度(百分百透过浓度为0.0267mg/mL)，得透过率。

2.5 数据处理

3 结果与讨论

3.1 测定方法的选择

实验研究发现，PGG通过200nm～800nm荧光扫描，在505nm有最大吸收，在0.77μg/mL～30.8μg/mL浓度范围内与吸收值呈线性关系(图1)。实验同时对上述5种促进剂溶液进行了扫描，在200nm～800nm范围内无吸收。表明促进剂对测定无干扰。

图1 PGG的标准曲线

3.2 PGG经不同肠段渗透速率的比较

本研究采用不翻转肠囊作为体外实验模型，与外翻肠囊法比较，其优点在于黏膜侧供给液体积小、用药量少，适合较为贵重的大分子药物肠吸收研究。按照“2.3”项下方法，分别以10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的PGG对各肠段进行渗透速率试验。考察PGG在十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收情况，确定PGG的较佳的吸收肠段。渗透系数见表1。PGG在各肠段的渗透系数大小顺序为：十二指肠>空肠>结肠>回肠，其中，十二指肠和空肠的渗透系数无显著性差异，是回肠渗透系数的1.3倍、结肠的1.2倍。说明十二指肠为PGG的较佳吸收肠段，且随着PGG浓度的增加，各肠段对其吸收渗透系数与浓度呈非线性关系，该实验结果与文献结果相近[6]，说明PGG在各肠段的吸收也可能存在主动转运过程。另外，从总体上看，PGG在一定程度上能够透过小肠和大肠，但透过量还是较低，经检测，2h供给液中人参糖蛋白含量与初始供给液含量比较，仍有90%以上保留在供给液中。

表1PGG经大鼠不同离体肠段的渗透系数

Table1PermeationcoefficientsofPGGacrossratintestinalmucosaeinvitro

PGG浓度(μg/mL)Concentration十二指肠Duodenal空 肠Jejunum回 肠Ileum结 肠Colonic100.40±0.050.39±0.200.30±0.240.33±0.07200.43±0.020.41±0.180.34±0.200.37±0.11400.47±0.080.46±0.150.35±0.150.39±0.09800.41±0.070.40±0.160.32±0.190.33±0.10

3.3 吸收促进剂对PGG肠渗透的影响

文献报道，吸收促进剂通常对小肠下段或大肠的作用效果较小肠上段好[7]．“3.2”项的试验结果表明，PGG经十二指肠渗透最佳，故本研究选择十二指肠和结肠考察不同促进剂对PGG肠渗透的影响。

不同吸收促进剂作用下，PGG经离体十二指肠和结肠的渗透系数及增渗比计算结果显示，各促进剂均不同程度增加PGG透过十二指肠和结肠。以P值比较各促进剂作用强弱，经十二指肠渗透，P值大小顺序为壳聚糖>去氧胆酸钠>癸酸钠>十二烷基硫酸钠>卵磷脂；经结肠渗透，P值大小顺序为壳聚糖>癸酸钠>去氧胆酸钠>十二烷基硫酸钠>卵磷脂。结果显示，各促进剂于十二指肠和结肠的增渗比高低不同，表明十二指肠和结肠对各促进剂的作用敏感性有差别，但壳聚糖对PGG的渗透吸收和增渗比均以十二指肠最高，表明壳聚糖为PGG在肠道吸收的最佳促进剂。

表2不同吸收促进剂对PGG经离体大鼠十二指肠和结肠渗透的影响

Table 2 Effect of absorption enhancers on the permeation of PGG across the rat duodenal and colonic mucosae in vitro (n=3，±s×10-6cm/s)

注：*.与对照组比较，P<0.01Note:*.Vs control group，P<0.01

4 结论

本研究结果发现，大鼠的离体十二指肠是人参糖蛋白最佳吸收部位；在体外扩散池实验中，壳聚糖对人参糖蛋白的吸收促进作用最显著。本研究初步阐述了几种吸收促进剂的作用效果，对人参糖蛋白口服给药系统的深入研究及不同吸收促进剂作用机制研究提供了依据。

[1]Ying Wang,Yinghong Chen,Hong Xu,et al.Analgesic effects of glycoproteins from Panax ginseng root in mice[J].Journal of Ethnopharmacology,2013,148(3):946-950.

[2]Ezharul H C.Oral Nano-insulin Therapy:Current Progress on Nanoparticle-based Devices for Intestinal Epithelium-targeted Insulin Delivery[J/OL].Journal of Nanomedicine and Nanotechnology,2012-01-11[2014-12-15].http:∥dx.doi.org/10.4172/2157-7439.S4-007.

[3]黄敏,吴伟.蛋白多肽类口服给药系统[J].中国临床药学杂志,2004,13(3):183-187.

[4]Miura,Kanebako,Shirai,et al.Influence of particle design on oral absorption of poorly water-soluble drug in a silica particle-supercritical fluid system[J].Chem Pharm Bull,2011,59(6):686-691.

[5]Gurny R and Junginger HE.Bioadhesion-Possibilities and Future Trends[M].Stuttgart:Wissenchaftliche Verlagsgesellschaft,1990:186-195.

[6]赖臖,廖正根,梁新丽,等.吸收促进剂对葛根素肠吸收的研究[J].江西中医学院学报,2009,21(4):30-32.

[7]Aungst B J.Intestinal permeation enhancers[J].J Pharm Sci,2000,89(4):429-442.