茯苓皮多糖和三萜类物质提取及其抗氧化活性研究

陈红梅

(安庆师范学院 生命科学学院， 安徽 安庆 246011)

茯苓皮多糖和三萜类物质提取及其抗氧化活性研究

陈红梅

(安庆师范学院 生命科学学院， 安徽 安庆 246011)

采用超声辅助提取法分别从茯苓皮中提取多糖和三萜类物质。考察提取溶剂、超声功率、液料比、提取温度、提取时间等对茯苓皮多糖和三萜类物质的影响。结果表明，选用乙醇提取多糖，选用乙酸乙酯浸提三萜类物质，最佳提取条件为：超声功率450 W，液料比为45 mL/g，提取温度80℃，提取时间35 min。通过对DPPH自由基清除作用、还原力、羟基自由基清除作用的测定，评价茯苓皮中多糖和三萜类物质的抗氧化活性。结果表明，抗氧化能力与质量浓度存在量效关系。在质量浓度达到0.4 mg/mL时，茯苓皮多糖和三萜类物质提取液对DPPH和羟基自由基的清除能力均高于VC；茯苓皮三萜类物质提取液还原力与VC相当。茯苓皮提取物作为一种天然的抗氧化剂具有良好的应用前景。

茯苓；多糖；三萜；抗氧化活性

茯苓，大多埋于地下，腐生或寄生于松科植物马尾松或赤松根部，为担子菌纲多孔菌科茯苓属[Poriacocos(Schw.) Wolf]，俗称松苓、茯兔、松柏玉等，是一种药食两用的真菌。茯苓在中国主要有三大产区，分别是安徽、云南和福建。茯苓为传统中药，具有利水渗湿、健脾和胃、养心安神、利尿、增强机体免疫等功能[1-2]，在古代就被称为“四时神药”，成为多种方剂的配伍组方。茯苓富含多种有效成分，包括茯苓多糖、三萜类、月桂酸、麦角甾醇、腺嘌呤及胆碱等活性物质，具有很高的药用及营养价值[3]。现代研究表明，茯苓具有抗诱变、增强机体免疫、促进细胞分裂、抗炎抑菌、补体激活等药理活性[4-5]。其中，茯苓多糖和三萜类物质是最重要的有效成分。

茯苓多糖主要成分为β-茯苓聚糖，是β-(1，3)-D-葡萄糖聚合体，β-茯苓聚糖本身没有生物活性，只有支链切断后才表现出生物活性。茯苓多糖具有降血糖、增强机体免疫力、抗肿瘤、预防衰老等作用，具有广泛的应用前景[6]。三萜类物质广泛存在于自然界，不同产地的茯苓，三萜类物质成分也不尽相同。三萜类物质具有广泛的生物活性，具有利尿、抗肿瘤、抗炎、抗菌、增强免疫、抗生育等活性[7]。

茯苓菌核的外皮即为茯苓皮，在茯苓加工过程中常被作为下脚料而被丢弃，本研究对茯苓皮中的多糖和三萜类物质的含量进行测定，同时对茯苓皮多糖和三萜类物质提取物的还原力、羟基自由基清除率、DPPH自由基清除率进行测定，综合评价其抗氧化活性。据此，旨在为茯苓的综合利用提供理论依据，也为其应用于天然抗氧化剂的开发提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茯苓皮洗净于烘箱中60℃烘干，粉碎，过60目筛备用。

齐墩果酸标准品购自Sigma公司，1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)购自Sigma公司，无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、香草醛、抗坏血酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FW-100高速粉碎机(上海楚定分析仪器有限公司)；FA2004A型电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；HH-6型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；UV-2000型紫外-可见分光光度计(上海尤尼柯公司)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线的制作

准确称取干燥至恒重的葡萄糖标准品10.0 mg，加适量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，定容，得到质量浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。准确量取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 mL葡萄糖标准溶液于试管中，分别加入蒸馏水将体积补充至1 mL，再加入2 mL 5%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸溶液，混匀，于室温放置20min，在波长490 nm处分别测定吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.1377x-0.1497，R2=0.9992。

1.3.2 齐墩果酸标准曲线的制作

准确称取干燥至恒重的齐墩果酸标准品20.0mg，取适量无水乙醇溶解后转入100mL容量瓶中，定容，得到质量浓度为0.2mg/mL的标准溶液。准确量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7mL齐墩果酸溶液于试管中，水浴挥干溶剂，分别加入香草醛-冰乙酸和高氯酸，置于65℃恒温水浴中加热15min，取出用流动冷水冷却，再分别加入5mL冰乙酸，混匀，在波长550nm处测定吸光度值。以齐墩果酸质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.1717x-0.2231，R2=0.9975。

1.3.3 茯苓皮中多糖的提取及含量测定[8]

准确称取茯苓皮粉末各5.0g，置于烧瓶中，加入一定量的石油醚浸泡，过滤，滤渣分别用蒸馏水和乙醇溶液于超声波清洗器中反复抽提一段时间，减压浓缩，再分别加入3倍体积的无水乙醇，静置过夜收集沉淀，沉淀用蒸馏水溶解并定容至50mL容量瓶中，待用。取此样品溶液，按照1.3.1的方法显色，在波长490nm处测定吸光度值，根据回归方程计算得出样品中多糖的含量。

1.3.4 茯苓皮中三萜类物质的提取及含量测定[9]

准确称取茯苓皮粉末各5.0g，置于烧瓶中，分别加入乙醇溶液、乙酸乙酯和石油醚溶液，在超声波清洗器中回流提取一段时间，分别抽滤，再置于旋转蒸发仪上减压浓缩回收溶剂至近干，得到黑色浸膏，加入乙醇溶解并定容至50mL容量瓶中，待测。取此样品溶液，按照1.3.2的方法显色，在波长550nm处测定吸光度值，根据回归方程计算得出样品中三萜类物质的含量。

1.3.5 单因素试验

准确称取茯苓皮粉末5.0g，分别考察不同提取溶剂、超声功率、液料比、提取温度、提取时间对茯苓皮多糖和三萜类物质得率的影响。

1.3.6 茯苓皮提取物抗氧化活性测定

1)DPPH分别吸取0.5mL质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.3和0.4mg/mL的样品溶液同0.15mmol/L的DPPH乙醇溶液2.5mL混合，充分摇匀，在室温下于暗室中反应1h后在517nm波长处测定吸光度值，以未加入样品的DPPH乙醇溶液为空白。同时，以VC和BHT作阳性对照。按式(1)计算DPPH自由基的清除率。

(1)

式中：D(517 nm)0为空白溶液吸光度测定值；D(517 nm)1为样品溶液吸光度测定值。

2)还原力 分别吸取1.0mL质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.3和0.4 mg/mL的样品溶液同pH值6.6的磷酸盐缓冲溶液2 mL和1%铁氰化钾溶液2 mL混合，充分摇匀，置于55℃恒温水浴锅中保温25 min，迅速冷却，加入三氯乙酸2 mL，充分摇匀，于4500 r/min下离心10 min。取上清液2 mL同0.2% FeCl3溶液0.5 mL和蒸馏水1 mL混合，充分摇匀后静置10 min，在波长700 nm处测定其吸光度值，以蒸馏水为空白。另以VC作阳性对照。吸光度值可以评价样品的还原力，吸光度值越大，则样品的还原力越强[10]。

3)羟基自由基 分别吸取1.0 mL质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.3和0.4 mg/mL的样品溶液于试管中，依次往其中加入5 mmol/L水杨酸溶液1.0 mL、5 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、蒸馏水2.0 mL，充分混匀后再加入5 mmol/L的H2O2溶液1.0 mL，置于37℃水浴中保温30 min，加入0.15 mol/L EDTANa2溶液0.5 mL终止反应，测定其在510 nm处的吸光度值，以蒸馏水为空白。VC作阳性对照。按式(2)计算羟基自由基(·OH)的清除率。

(2)

式中：D(510 nm)0为空白溶液吸光度测定值；D(510 nm)1为不加H2O2的黄酮溶液吸光度测定值；D(510 nm)2为加入黄酮溶液后的吸光度测定值。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 提取溶剂对茯苓皮中多糖、三萜类物质的得率的影响

选用蒸馏水和乙醇分别提取茯苓皮多糖，结果如表1所示。用乙醇作为提取溶剂，多糖得率达到12.5%；蒸馏水提取液中多糖得率为8.7%。乙醇提取液中多糖得率高于蒸馏水提取液中多糖得率，且差异极显著(P<0.01)。选用乙醇作为提取溶剂浸提茯苓皮多糖。

表1 茯苓皮不同溶剂提取物多糖得率

注：表中数据用平均值±标准差表示。

表2 茯苓皮不同溶剂提取物三萜含量

注：表中数据用平均值±标准差表示。

选用乙醇、乙酸乙酯和石油醚分别提取茯苓皮中三萜类物质，结果如表2所示。乙酸乙酯提取液和石油醚提取液中三萜类物质得率均高于乙醇提取液三萜类物质得率，且差异极显著(P<0.01)，其中乙酸乙酯提取液中三萜类物质得率又较石油醚提取液中得率高，差异显著(P<0.05)，含量达到19.9%。选用乙酸乙酯作为提取溶剂浸提茯苓皮中三萜类物质。

2.1.2 超声功率对茯苓皮多糖、三萜类物质的影响

在不同的超声功率(300、350、400、450、500、550和600 W)下，分别按液料比20 mL/g，提取温度50℃，提取时间30 min进行提取，结果如图1所示。从图1可知，随着超声功率的增加，茯苓皮多糖得率也随之上升，当功率达到450 W时，此时继续增加超声功率，多糖得率仍在上升，但上升趋势较缓慢。而当功率达到450 W，继续增加超声功率，此时茯苓皮三萜类物质得率反而呈下降趋势。选择超声功率在450 W较为合适。

图1 超声功率对茯苓皮多糖、三萜类物质的影响

2.1.3 液料比对茯苓皮多糖、三萜类物质的影响

在超声功率450 W，以不同的液料比(15、25、35、45、55、65和75 mL/g)，分别按提取温度50℃，提取时间30 min进行提取，结果如图2所示。从图2可知，随着液料比的增加，茯苓皮多糖得率呈上升趋势，当液料比超过45 mL/g，此时多糖得率呈下降趋势；而随着液料比的增加，茯苓皮中三萜类物质呈上升趋势，但当液料比超过50 mL/g，此时三萜类物质呈缓慢增长趋势。考虑到得率及后期处理，以液料比为45 mL/g为宜。

图2 液料比对茯苓皮多糖、三萜类物质的影响

2.1.4 提取温度对对茯苓皮多糖、三萜类物质的影响

在超声功率450W，液料比45mL/g，分别按不同的提取温度(40、50、60、70、80和90℃)，提取时间30 min进行提取，结果如图3所示。从图3可知，随着提取温度的升高，茯苓皮多糖得率呈不断上升趋势，只是当温度达到80℃后，继续升高温度，多糖得率增长缓慢；随着温度的升高，三萜类物质得率也不断增加，但当温度超过80℃后，三萜类物质得率反而下降。提取温度可以设为80℃。

图3 提取温度对茯苓皮多糖、三萜类物质的影响

2.1.5 提取时间对茯苓皮多糖、三萜类物质的影响

在超声功率450 W，液料比45 mL/g，提取温度80℃，分别按不同的提取时间(15、25、35、45、55和65 min)进行提取，结果如图4所示。从图4可知，随着提取时间的延长，茯苓皮多糖和三萜类物质得率均呈先上升后降低的趋势。提取时间在45 min时，多糖得率达到最大；提取时间在35 min时，三萜类物质得率达到最大。考虑到得率及能耗，可以选择提取时间35 min。

图4提取时间对茯苓皮多糖、三萜类物质的影响

2.2 茯苓皮提取物抗氧化活性测定

2.2.1 DPPH自由基清除率

DPPH的醇溶液呈紫色，DPPH是一种稳定的含氮自由基，结构中含有孤对电子，可以与自由基清除剂提供的电子配对结合，使DPPH溶液褪色，根据吸光度值的大小可以评价抗氧化剂的抗氧化性[11-12]。由图5可知，茯苓皮多糖提取液和三萜类物质提取液对DPPH自由基有一定的清除作用，并且当提取液质量浓度由0.1 mg/mL增加至0.5 mg/mL时，多糖和三萜类物质对DPPH自由基的清除率也随之升高。随着对照品BHT和VC质量浓度的升高，其对DPPH的清除率逐渐增大。在质量浓度较低时，多糖和三萜类物质提取液对DPPH的清除率不如VC；而当三萜类物质提取液质量浓度达到0.3 mg/mL后，其对DPPH的清除率已经超过VC；当多糖提取液质量浓度达到0.4 mg/mL后，其对DPPH的清除率与VC相当，超过BHT对DPPH的清除率。

图5 茯苓皮多糖、三萜类物质提取液对DPPH自由基的清除作用

2.2.2 还原力测定

由图6可知，随着茯苓皮多糖和三萜类物质提取液质量浓度的升高，它们的还原力也在增加。对照品VC的还原力也随着其质量浓度的升高而增加。茯苓皮三萜类物质提取液的还原力与VC整体相当，当其质量浓度达到0.5 mg/mL时，甚至稍高于VC。而茯苓皮多糖提取液，其还原力不如三萜类物质提取液和VC。

图6 茯苓皮多糖、三萜类物质提取液的还原力

2.2.3 羟基自由基清除率

由图7可知，茯苓皮多糖提取液和三萜类物质提取液均具有一定的清除羟基自由基的作用，并且当提取液质量浓度由0.1 mg/mL增加至0.5 mg/mL时，多糖和三萜类物质对羟基自由基的清除率也在升高。随着对照品VC质量浓度的升高，其对羟基自由基的清除率也在增加。在质量浓度较低时，茯苓皮多糖提取液和三萜类物质提取液对羟基自由基的清除率与对照品VC相当，而当质量浓度升高到0.4 mg/mL时，多糖提取液和三萜类物质提取液对羟基自由基的清除能力均大于对照品VC的清除能力，其中多糖提取液对羟基自由基的清除能力又稍高于三萜类物质。

图7 茯苓皮多糖、三萜类物质提取液对羟基自由基的清除作用

3 结论

茯苓作为传统药材，其下脚料茯苓皮也具有一定的药理作用，尤其以消肿利水为长[13]。茯苓皮中有多糖和三萜类等物质的存在。多糖类物质和三萜类化合物近年来研究较多，二者均是重要的天然抗氧化物质。选用乙醇作为提取溶剂，从茯苓皮中提取多糖，选用乙酸乙酯浸提三萜类物质，最佳提取条件为：超声功率450 W，液料比为45 mL/g，提取温度80℃，提取时间35 min。

抗氧化实验表明，茯苓皮多糖提取液和三萜类物质均表现出较强的抗氧化活性。在一定范围内，茯苓皮多糖和三萜类物质提取液的抗氧化活性随着质量浓度的升高而增加。质量浓度较高时，多糖和三萜类物质提取液对DPPH的清除率超过VC和BHT。茯苓皮三萜类物质提取液的还原力和VC相当，稍高于多糖提取液的还原力。在质量浓度较高时，茯苓皮多糖和三萜类物质提取液对羟基自由基的清除能力均大于对照品VC。茯苓皮提取物的抗氧化能力总体来说要优于VC。

生物氧化是机体进行能量代谢和物质代谢必不可少的环节，生物体代谢过程中产生的自由基对机体会造成损伤，甚至会引起组织病变，引起人们对抗氧化物质的关注，天然抗氧化剂的开发具有良好的应用前景[14-15]。对茯苓皮多糖和三萜类物质的抗氧化作用进行研究，DPPH自由基的清除能力、还原力和羟基自由基的清除能力是评价抗氧化性的重要参数[16]。很多疾病的发生都与羟基自由基有着相当大的关系。DPPH自由基因为操作迅速、简便，目前也广泛用于评价抗氧化活性。还原力与抗氧化能力密不可分，还原力愈强意味着其抗氧化能力愈强。羟基自由基是一种活泼的自由基，具有较强的活性和毒性，可与组织细胞中的一些生物大分子发生反应，从而导致机体损伤[17-19]。羟基自由基是一种相对来说较难清除的自由基。深入研究茯苓皮提取物抗氧化作用对天然抗氧化剂的开发具有重要的应用价值。

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Study on extraction technology and antioxidative activity of polysaccharides and triterpenoids from peel ofPoriacocos

CHEN Hong-mei

(School of Life Science, Anqing Teachers College, Anqing 246011, China)

Microwave assisted extracting conditions of polysaccharides and triterpenoids from peel ofPoriacocoswere studied. The influence of extraction solvent, solvent-material ratio, ultrasonic power, temperature, extraction time was evaluated by single factor experiments. The results showed that the polysaccharides were obtained by ethanol, while the triterpenoids was obtained by ethyl acetate. The optimal conditions were as follows. Ultrasonic power 450 W; solvent-material ratio, 45 mL/g; temperature, 80℃; and extraction time, 35 min. The antioxidant activity was evaluated based on DPPH radical scavenging capacity, reducing power and hydroxyl free radical scavenging capacity. The ability of antioxidative activity was increased with the inerease concentrations of polysaccharides and triterpenoids. When extracted at the concentration of 0.4 mg/mL, polysaccharides and triterpenoids revealed relatively better DPPH radical scavenging capacity and hydroxyl free radical scavenging capacity than VC. Reducing power of riterpenoids was comparable to those of VC. Therefore, the peel ofPoriacocosis effective as novel natural antioxidants.

Poriacocos; polysaccharides; triterpenoids; antioxidative activity

2014-06-09；

2014-09-15

安徽省教育厅自然科学项目(KJ2011B081)

陈红梅，硕士，讲师，研究方向为植物生物化学，E-mail: hongmeichen2000@163.com。

R284.2

A

2095-1736(2015)02-0048-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.02.048