入侵植物意大利苍耳不同部位挥发油的化感作用及其化学成分的比较分析

邰凤姣, 韩彩霞， 邵 华

(1. 中国科学院新疆生态与地理研究所干旱区生物地理与生物资源重点实验室, 新疆乌鲁木齐 830011;2. 中国科学院大学, 北京 100049)

入侵植物意大利苍耳不同部位挥发油的化感作用及其化学成分的比较分析

邰凤姣1,2, 韩彩霞1， 邵 华1

(1. 中国科学院新疆生态与地理研究所干旱区生物地理与生物资源重点实验室, 新疆乌鲁木齐 830011;2. 中国科学院大学, 北京 100049)

采用水蒸气蒸馏法分别提取意大利苍耳 (XanthiumitalicumMoretti)叶、茎、果3个部位的挥发油，并通过GC-MS分析对其化学成分进行分析鉴定。在叶、茎、果挥发油中分别鉴定出25、23和27种化合物，分别占总成分的90.625%、93.041%和89.866%。其中，叶挥发油的主要成分是柠檬烯(25.541%)和龙脑(12.133%)，茎挥发油的主要成分是柠檬烯(62.85%)，而果挥发油的主要成分为γ-榄香烯(23.38%)、柠檬烯(14.18%)和吉玛烯B(16.279%)。以意大利苍耳入侵生境中常见杂草反枝苋 (AmaranthusretroflexusL.，双子叶植物)和早熟禾 (PoapratensisL.，单子叶植物)作为受试植物，在密闭容器中 (容积为1.4 L)放入不同质量的叶、茎、果部位(20 g、40 g和80 g)，检测其在模拟自然状态下产生的挥发物的化感作用；并采用培养皿法对不同浓度叶、茎、果挥发油(0.2 μL/mL、0.5 μL/mL、1 μL/mL、3 μL/mL和5 μL/mL)的化感作用进行生测。结果显示：意大利苍耳各部位在自然挥发条件下以及其挥发油均表现出较强的化感作用，其叶挥发油在5 μL/mL时可完全抑制两种受试植物种子的萌发，具有进一步开发为植物源除草剂的潜力。

意大利苍耳；挥发油；化感作用；萜类

化感作用是指供体植物通过茎叶挥发、淋溶、凋落物分解、根系分泌等途径向环境中释放化学物质，从而影响周围植物的生长与发育[1]。研究表明，化感作用是多种外来植物的重要入侵机制之一，通常会对入侵植物迅速占据生态优势起到至关重要的辅助作用[2-6]。植物产生的化感物质多为次生代谢产物，其中，挥发性化感物质不仅可以直接以挥发态作用于受体植物，还可以在土壤中积聚，并通过改变入侵地土壤的微生物群落结构及营养循环过程而进一步巩固其优势地位[7-10]。

中国是受外来种入侵影响较为严重的国家之一。在众多的外来植物中，意大利苍耳由于扩散速度快，危害严重而备受关注。意大利苍耳为菊科苍耳属一年生草本植物，原产于北美洲，现广泛分布于欧亚大陆及南北美洲。中国于1991年首次在北京发现该植物，由于其生长快速，适应性强，目前已经蔓延到广东、广西、河北、新疆、辽宁、山东等地[11]。由于意大利苍耳易于扩散、危害严重、防控困难，2007年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》[12-13]。目前对于意大利苍耳的研究报道主要集中在关于其生物学特性及危害性等方面的描述，对于其所产生的次生代谢产物，尤其是挥发性物质的性质及功能研究较少。我们前期的研究表明，意大利苍耳植株地上部分的石油醚提取物以及全株挥发油能够显著抑制受试植物幼苗的生长[14-15]。本文则进一步分析比较了意大利苍耳3个不同部位(叶、茎、果)挥发油的化学成分，并对其在模拟自然状态下的化感作用以及其挥发油的化感作用进行了比较分析，以期为进一步揭示挥发性化感物质在意大利苍耳成功入侵过程中所起的作用提供科学依据，同时探索将其开发为对环境无污染的生物除草剂的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

意大利苍耳成熟植株于2014年7—8月采自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市郊区 (43o54′40.2″N，87°17′7.6″E，海拔500～1000 m)。该地区属于典型的温带大陆性气候，冬季漫长寒冷，夏季干旱少雨，年积温1600～3400 ℃，年平均降水量仅236 mm，主要集中在6—8月份，年蒸发量达2300 mm左右，蒸发量远远大于降雨量。常年以西风为主导方向，平均风速2.5 m/s[16-17]。将采集的意大利苍耳植株分为叶、茎、果3个部分，用水蒸气蒸馏法提取挥发油。

1.2 方法

1.2.1 种子消毒

种子常带有病原菌，因此播种前对种子进行消毒处理。将反枝苋 (AmaranthusretroflexusL.)和早熟禾(PoapratensisL.)种子清洗干净，用体积分数为5%的次氯酸钠溶液浸泡5 min，再用无菌水冲洗多次后备用。

1.2.2 意大利苍耳不同部位模拟自然挥发条件下的化感作用

从意大利苍耳新鲜植株上分别剪取叶、茎、果3个部位，按照不同质量数(20 g、40 g和80 g)分置在边长为13 cm、容积为1.4 L的正方体塑料密封盒的底部，对照不放置任何植株。在9 cm的培养皿中铺上一张滤纸，加入5 mL蒸馏水后，将消毒后的反枝苋和早熟禾种子均匀地放在培养皿中，每个培养皿各撒15粒种子，然后置于放有植物材料的密封盒中，盖好盖子后置于25 ℃下黑暗培养，每天打开盒盖通风30 min。每个处理设置3个重复，以胚根和胚芽突破种皮达1～2 mm为发芽标准，每天记录种子的发芽数量，7 d后测定反枝苋幼苗根长和苗高，8 d后测定早熟禾的根长和苗高。

1.2.3 挥发油的提取

将新鲜的意大利苍耳叶、茎、果分别以水蒸气蒸馏法提取挥发油，所得挥发油以无水硫酸钠处理后，置于密封瓶中，在冰箱中4℃下保存以备用。

1.2.4 挥发油的GC-MS分析

意大利苍耳各部位的挥发油成分由安捷伦7890A/5975C GC-MS 系统进行分析，色谱柱为HP-5MS石英毛细管色谱柱 (30 m×250 μm×0.25 μm)。载气为氦气，流速1 mL/min. 柱温为60℃，保持5 min，以2℃/min升至270 ℃，保持3 min。进样温度300℃，进样量0.5 μL，分流比10∶1。质谱条件： EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，质量扫描范围33～600 amu。以C6-C28混合正构烷烃在同样条件下进样，通过计算保留指数(RI)，结合NIST谱库检索结果进行成分鉴定，并通过峰面积归一化法计算各成分的相对含量。

1.2.5 意大利苍耳各部位挥发油的化感作用

用蒸馏水将植株不同部位的挥发油配制成浓度为5 μL/mL的叶、茎、果的挥发油溶液(以<0.05%丙酮助溶)，以此为母液，依次将溶液稀释为3 μL/mL、1 μL/mL、0.5 μL/mL和0.2 μL/mL。在直径为9 cm的培养皿中放置一张滤纸，加入5 mL挥发油溶液，以蒸馏水为对照，将反枝苋和早熟禾种子均匀地放在培养皿中，每个培养皿各撒15粒种子，培养皿以封口膜密封后置于25 ℃下黑暗中培养，每个处理设3个重复。以胚根和胚芽突破种皮达1～2 mm为发芽标准，每天记录种子的发芽数量，7 d后测定反枝苋幼苗根长和苗高，8 d后测定早熟禾的根长和苗高。

1.3 数据处理

幼苗的根长和苗高采用化学效应敏感指数计算，RI=1-C/T(当T≥C时)，RI=T/C-1(当T≤C时)。其中，C是对照值，T是处理值，RI代表化感效应，当RI>0时表示促进作用，当RI<0时为抑制作用，RI的绝对值代表化感强度的大小，RI越大说明化感强度越强，反之则降低[18]。发芽率及根长苗高数据使用SPSS 19.0、EXCEL等软件进行数据处理，利用单因素分析进行方差分析，并通过LSD法比较不同处理组间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 意大利苍耳不同部位在模拟自然挥发状态下的化感作用

在模拟自然挥发的状态下，意大利苍耳叶在低质量数下(20 g/1.4 L)对反枝苋种子早期的萌发表现出明显的促进作用，而高质量数(40 g/1.4 L和80 g/1.4 L)时发芽率呈降低趋势，但最终发芽率与对照无显著差异(图1)。而意大利苍耳叶对早熟禾种子萌发则表现为低质量数下作用不显著，高质量数下达到显著抑制作用，当质量数达到80 g/1.4 L时，其发芽率仅为对照的54.5%。意大利苍耳茎对反枝苋的影响表现为低质量数时作用不显著，高质量数时每日发芽个数显著增加，并在80 g/1.4 L 时使反枝苋的最终发芽率比对照提高了22.22%，但是对早熟禾的发芽率基本无显著影响。意大利苍耳果对反枝苋每日发芽个数随质量的变化趋势与叶相同，先增加后降低，最终发芽个数差异不显著；而对早熟禾的种子萌发则基本没有作用。

图1 意大利苍耳不同部位对反枝苋和早熟禾发芽的影响

随着质量数的增加，意大利苍耳各部位挥发物对受试植物幼苗生长的抑制作用也呈现出增加的趋势。意大利苍耳叶和果的挥发物在40 g/1.4 L和80 g/1.4 L时显著抑制了反枝苋幼苗的生长，其中，叶挥发物对反枝苋根长和苗高的RI分别达到了-0.465和-0.476(表1)。各部位对早熟禾的影响趋势与反枝苋基本一致，但是意大利苍耳叶的挥发物对早熟禾幼苗根长和苗高的抑制作用更为强烈，在质量数为80 g/1.4 L时，其RI分别达到了-0.8和-0.646。意大利苍耳茎挥发物的化感作用最弱，对于两种受试植物反枝苋和早熟禾的幼苗生长基本无显著影响。

2.2 意大利苍耳不同部位挥发油的化感作用

图2 意大利苍耳不同部位挥发油对反枝苋和早熟禾发芽的影响

由图2可以看出，意大利苍耳各部位挥发油显著抑制了反枝苋种子的萌发，并表现出明显的浓度效应。在相同处理浓度下，反枝苋种子发芽率的顺序为果>茎>叶，而叶挥发油在3 μL/mL时完全抑制了种子萌发。与反枝苋相比，意大利苍耳各部位挥发油对早熟禾种子的萌发抑制作用较弱，其发芽率在低浓度挥发油处理下有一定程度的提高，而后随着浓度的增加逐渐降低；除了在5 μL/mL时，3种挥发油对早熟禾种子发芽率的抑制强度为茎>果>叶，这与反枝苋不同。同样，叶挥发油表现出最强的抑制作用，当浓度为5 μL/mL时彻底抑制了种子的萌发。

意大利苍耳各部位挥发油对受试植物幼苗的生长同样表现出明显的浓度效应(表2)。和对发芽率的影响一样，在3种挥发油中，叶的作用最强，在5 μL/mL时完全抑制了两种受试植物种子的萌发，而茎和果挥发油的作用次之，并且表现出一定的选择性。在浓度为5 μL/mL时，茎和果挥发油对反枝苋根长的RI分别为-0.979和-0.975，而对早熟禾仅为-0.656和-0.575。

2.3 意大利苍耳不同部位挥发油的化学成分分析

从意大利苍耳叶、茎、果的挥发油中分别得到33、29和40种化合物，从中鉴定出25、23和27种化学成分，分别占总成分的90.625%、93.041%和89.866%。由表3可知，叶和茎挥发油中的主要成分是柠檬烯，相对含量分别为23.24%和61.14%。叶挥发油中相对含量大于5%的还有α-蒎烯(6.286%)、龙脑(12.133%)、β-环柠檬醛(6.242%)、乙酸龙脑酯(6.924%)及δ-荜澄茄烯(6.682%)。在茎的挥发油中相对含量比较高的化学物质还有(-)-4-萜品醇(5.695%)和β-侧柏烯(4.955%)。果挥发油的主要成分为柠檬烯(14.18%)、γ-榄香烯(23.38%)、α-石竹烯(7.51%)及吉玛烯B(16.279%)。这些鉴定出的化学成分主要是单萜和倍半萜类化合物。

表1 模拟自然挥发状态下意大利苍耳不同部位对反枝苋和早熟禾生长的影响

表中数值=平均值±标准误，n=20; 同列不同小写字母表示差异显著(P<0. 05)；下同。

表2 意大利苍耳不同部分挥发油对反枝苋和早熟禾生长的影响

3 结论与讨论

研究表明，多种植物可以通过向周围环境中释放挥发性化感物质，来影响其它植物的种子萌发和幼苗生长，而它们产生的挥发油也被证明对受试植物具有显著的生长抑制作用[19-20]。这些挥发物质既可以气态方式存在于植物周围，也可以通过沉降、雨水淋溶或凋落物分解等方式进入土壤中起作用[21]。例如，在对灌木鼠尾草化感作用的研究中发现，该植物的叶片可产生樟脑、桉树脑、莰烯、α-和β-蒎烯5种单萜类化合物。从灌丛周围的空气中可以检测到樟脑和桉树脑，从灌丛周围的土壤中也可以检测到樟脑、桉树脑和莰烯，而这几种化合物均在单独应用时对受试植物表现出显著的生长抑制作用[22]。Inderjit 等[9]的研究发现，紫茎泽兰凋落的叶片可以向周围环境中释放挥发性化感物质而影响伴生植物生长；施蕊等[23]发现，入侵植物薇甘菊的挥发油可显著抑制受试植物种子萌发和生长；而Barney等[7]在对北美入侵植物艾蒿的研究中发现，其挥发性单萜类化感物质并非是通过气态直接起作用的，而是通过在入侵地土壤中积累来巩固该植物的入侵优势地位。意大利苍耳产生的挥发性化感物质究竟是通过哪种方式来影响周围植物生长，还有待进一步的研究。

表3 GC-MS鉴定意大利苍耳不同部位各种化学成分和相对含量

由于意大利苍耳的挥发油是通过水蒸气蒸馏法提取的，与自然挥发条件有所不同，因此，其产生的挥发性物质的化学成分、相对含量也不尽相同；但是，总体来说，意大利苍耳的挥发性物质在模拟自然状态下，以及用其挥发油直接进行生测的结果均表现出对受体植物较强的抑制作用。在鉴定出来的意大利苍耳各部位的挥发油的41个化学成分中，有15个是3个部位的共有成分，1个是茎和果的共有成分，1个是茎和叶的共有成分，还有2个是叶和果的共有成分，剩余22个为某种部位的独有成分。意大利苍耳各部位挥发油的这种组成特点，既表达了作为同一种植物上不同器官所产生的次生代谢产物的同源性，又表现出了由于各个器官结构、功能的差异而产生的异质性。各个部位挥发油中的主要成分均为单萜和倍半萜类化合物。据报道，萜类是具有化感作用的化合物，并可以通过挥发、淋溶、分泌和植物残体分解等途径进入环境，从而引起周围生态系统和生物群落的变化[24-26]。有研究表明，某些单萜类化合物具有抑制植物发芽和生长的化感作用[24]。意大利苍耳中发现的柠檬烯、蒎烯、月桂酸、罗勒烯、榄香烯、莰烯、龙脑和石竹烯等化合物，在其它具化感作用的植物挥发油中也有报道[27-30]。其中，单萜类化合物柠檬烯是3个部位挥发油中含量较高的共有成分；但是，由于柠檬烯的化感作用强度很弱，不能够解释意大利苍耳各部位挥发油对受试植物生长的抑制作用[15]。因此，意大利苍耳挥发油的化感作用既有可能归功于其中的作用较强的某个单一化学成分，更有可能是若干作用并不太强的化学成分组合在一起之后产生了协同作用。化感物质的协同作用现象是普遍存在的，而萜类物质的协同作用尤为显著[31-32]。此外，值得注意的是，挥发性化感物质进入土壤之后，还可以引发一系列复杂的生态学效应，也就是间接性的化感作用。例如，土壤中的化感物质有可能会改变土壤养分的动态过程(如有机质动态及养分循环过程等)，以及改变土壤中的微生物群落结构和功能，从而形成更加有利于其自身生长和繁殖的微生态环境[8, 10]。除挥发性化感物质外，我们从意大利苍耳中还鉴定出了苍耳皂素等非挥发性的倍半萜内酯类化感物，它们是否和挥发性化感物质之间产生协同甚至拮抗作用，尚需做进一步的研究[14]。

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Comparison of the allelopathic effects of the volatile oils from different parts ofXanthiumitalicumMoretti

TAI Feng-jiao1,2, HAN Cai-xia1, SHAO Hua1

(1. Key Laboratory of Biogeography and Bioresource in Arid Land, Xinjiang Institute of Ecology and Geography,Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The essential oils was obtained from leaf, stem and fruit ofXanthiumitalicumMoretti by steam distillation method, and their chemical composition was identified by GC-MS. Total 25, 23, and 27 compounds were identified from leaf, stem, and fruit oils, accounting for 90.625%, 93.041% and 89.866% of the total oil, respectively. The main components of leaf, stem and fruit oils were limonene(25.541%)and borneol(12.133%)， limonene(62.85%)， γ-elemene (23.38%)， limonene (14.18%) and germacrene B (16.279%).AmaranthusretroflexusL., a dicot plant, andPoapratensisL., a monocot plant, which can be found to grow in the habitats that are invaded byX.italicum, were used as tested species to evaluate the allelopathic effects of the plant′s volatile oils. Different amounts (20, 40 and 80 g/1.4 L) of fresh cut leaves, stems and fruits ofX.italicumwere placed in air tight containers to simulate its natural conditions to emit volatile oils into the environment, and petri dish bioassay method was used to evaluate the phytotoxic activity of its essential oils at different concentrations (0.2 μL/mL, 0.5 μL/mL, 1 μL/mL, 3 μL/mL and 5 μL/mL). Results showed that the volatile oils of different plant parts exhibited significant allelopathic effect both under simulated natural conditions and in the petri dish bioassay, and leaf oil has the potential to be utilized as a natual herbicide.

XanthiumitalicumMoretti; essential oil; allelopathy; terpenes

2014-10-09；

2014-11-03

中科院西部之光联合学者项目(LHXZ201202)

邰凤姣，硕士研究生，主要从事植物化感作用等方面的研究，E-mail:taifengjiao1987@163.com；

邵华，博士，副研究员，主要从事化感、挥发油等方面的研究，E-mail: shaohua@ms.xjb.ac.cn。

R284

A

2095-1736(2015)02-0036-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.02.036