硝菔通结方对功能性便秘大鼠肠道水液代谢的影响*

王郁金 周永学△ 张 红 闫曙光 满思艺 谢 培 李 莎

成都中医药大学(成都610075)

硝菔通结方对功能性便秘大鼠肠道水液代谢的影响*

王郁金▲周永学△▲张 红▲闫曙光▲满思艺▲谢 培▲李 莎▲

成都中医药大学(成都610075)

目的：探讨硝菔通结方对功能性便秘大鼠肠道水液代谢的影响 。方法：成年SD雄性大鼠50只，随机分为空白对照组、模型组、硝菔通结方高、中、低剂量组各10只。采用复方地芬诺酯灌胃建立SD大鼠功能性便秘模型，造模成功后各治疗组分别给予不同剂量硝菔通结方灌胃3周。观察各组大鼠首粒黑便的排出时间、粪便含水率、结肠含水率、免疫组化检测大鼠结肠组织中VIP及AQP3的表达。结果：与空白组比较，模型组大鼠粪便量少、质地干硬,首粒黑便排出时间明显延长，粪便含水率和结肠含水率减少，结肠组织中VIP表达降低、AQP3的表达升高。与模型组比较，硝菔通结方各剂量组大鼠粪便量增加，质地稀软，首粒黑便时间缩短，大便含水率增多，结肠含水率增多，结肠组织中VIP表达升高，AQP3的表达降低。结论：大鼠功能性便秘的发生与肠道水液代谢障碍有关，硝菔通结方可通过调节肠道水液代谢治疗功能性便秘。

功能性便秘是临床常见的消化系统疾病，罹患人数逐年增加，虽然一般不直接危及生命,但给患者生活上带来极大的不便,并且可以诱发或加重其它疾病(如高血压、冠心病、心力衰竭等),甚至导致患者致残或死亡。所以随着人们对生活质量的逐步重视, 提高便秘的治疗效果已成为一个迫切的临床课题。近年来，中医药治疗便秘，取得了良好的疗效，但许多药物含有蒽醌类成分，不宜长期服用。本课题组前期研究发现硝菔通结方对功能性便秘疗效确切，且该方不含蒽醌类成分。因此我们进一步观察该方对功能性便秘大鼠首粒黑便的排出时间、粪便含水率、结肠含水率、结肠组织中VIP及AQP3的表达，明确其治疗功能性便秘的作用机制，为该方的临床应用提供理论依据。

1 材 料 1.1 动 物 清洁级SD大鼠，雄性，50只，体重200±20g，购于西安交通大学医学院实验动物中心，许可证号SCXK(陕)2012-003。

1.2 药物及制备 硝菔通结方(肉苁蓉Cistanche deserticola Ma15g、当归Angelica sinensis15g、芒硝Natrii Sulfas30g、鲜莱菔Raphanus sativus L1000g)，上述中药饮片购于陕西省咸阳市百姓乐大药房，并经陕西中医学院药理实验室鉴定；以上药物鲜莱菔切片，分两次同芒硝水煎，得浓汁，入肉苁蓉、当归同煎，并浓缩至56mL(19g·mL-1)，4℃冰箱保存备用。复方地芬诺酯片：江苏常州康普药业有限公司。

1.3 试剂与仪器 免疫组化染色试剂盒，购于武汉博士德生物工程有限公司；水合氯醛：上海山浦化工有限公司，生产日期：2012年11月10日；金属恒温加热器，生产序号：BC890301，上海博彩生物技术有限公司；生物组织自动脱水机：TC-120型，产品型号：S时代先锋型，湖北泰维科技实业有限公司；生物组织包埋机：TB-718E型；湖北泰维科技实业有限公司； 电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒科技仪器有限公司。

2 实验方法 2.1 动物分组 SD雄性大鼠50只，体重200±20g，随机分为空白对照组、模型组、硝菔通结方高(380g·kg-1)、中(190g·kg-1)、低(95g·kg-1)剂量组各10只。

2.2 功能性便秘大鼠模型的建立 动物禁食不禁水16h后，以10mL·kg-1体积(15mg·kgmL-1浓度)给予复方地芬诺酯混悬液灌胃，每天1次，当大鼠出现精神状态差，进食减少，体重减轻，大便粒型小、干硬等表现时，为造模成功。

2.3 给药方法 造模成功的模型大鼠，按照以下分组进行硝菔通结方治疗。空白组和模型组正常饲养，以0.9%NaCl灌胃；中药低中高剂量组分别以不同浓度的硝菔通结方水煎剂予以灌胃，共灌胃药3周。

2.4 指标的检测 2.4.1 一般行为学观察：每日观察动物一般行为表现及排便情况。

2.4.2 首粒黑便、粪便含水率、结肠含水率观测：采用活性炭灌胃法测定首粒黑便时间，观察肠道传输功能，硝菔通结方治疗后，每组随机挑取5只大鼠，单只放于大鼠代谢笼内，禁食16h后，经口灌入100g/L活性炭混悬液2mL，从活性炭灌胃完毕开始记录大鼠第一粒黑便排出时间。给药结束后，将大鼠放于代谢笼，收集24h粪便，称其湿重，粪便60℃恒温干燥箱，称其干重，计算粪便含水率。粪便含水率=(湿重-干重)/湿重×100%。给药结束后，实验动物禁食不禁水24h，10%的水合氯醛 4mL/kg腹腔注射麻醉，取肛门上方部位结肠组织2cm，用预冷的生理盐水清洗，称取湿重，置于60℃恒温干燥箱干燥，称其干重，计算结肠含水率。结肠含水率=(湿重-干重)/湿重*100%。

2.4.3 免疫组化检测结肠组织中VIP、AQP3的表达：给药结束后，实验动物禁食不禁水24h，10%的水合氯醛 4mL/kg腹腔注射麻醉，取回盲部以下结肠组织浸入10%中性甲醛固液固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，4μm切片，脱蜡脱水，3%H2O2室温孵育5～10min，蒸馏水冲洗,PBS浸泡5 min x2，5-10%山羊血清封闭,室温孵育10min，一抗4℃过夜,二抗37℃ 孵10～30 min,滴加适量辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液,37℃孵育10～30min,显色剂显色3～15min，冲洗、复染、脱水、透明、封片后显微镜下观察。

3 实验结果 3.1 一般行为表现 复方地芬诺酯灌胃造模28天后，各造模组大鼠精神状态差，被毛脱落,活动减少，大便量少干硬，粒型小，空白组大鼠精神状态良好、二便正常，造模成功。硝菔通结方治疗后，各给药组大鼠上述症状逐渐减轻并恢复，尤以高中剂量组效果最为明显。

3.2 硝菔通结方对功能性便秘大鼠首粒黑便排出时间、粪便含水率、结肠含水率的影响 与空白组比较，模型组大鼠首次黑现时间显著延长(P<0.01)，粪便含水率减少(P<0.05)，结肠含水率明显减少(P<0.01)；与模型组比较，硝菔通结方各剂量组大鼠首粒黑便排出时间均明显缩短(P<0.01)，粪便含水率高剂量组明显增多(P<0.01)，中剂量组也增多(P<0.05)，低剂量组无显著性差异，结肠含水率高剂量组明显增多(P<0.01)，中剂量组和低剂量组也增多(P<0.05)， 见表1。

表1 硝菔通结方对功能性便秘大鼠首粒黑便排除时间、粪便含水率、结肠含水率的影响

组 别剂量/g·kg⁃1首粒黑便排除时间/min粪便含水率(%)结肠含水率(%)空白组⁃177．66±21．5051．44±6．2575．68±6．63模型组⁃287．69±25．99◆43．27±5．34◇68．56±7．91◆硝菔通结方大剂量组380169．45±23．99△54．03±9．35△79．16±7．52△硝菔通结方中剂量组190184．24±13．43△49．16±5．92▲76．34±6．78▲硝菔通结方小剂量组95206．74±38．49△45．24±8．5573．38±5．39▲

注：与空白组比较◇P<0.05，◆P<0.01；与模型组比较▲P<0.05，△P<0.01

3.3 硝菔通结方对功能性便秘大鼠结肠组织中VIP、AQP3免疫组化染色半定量分析 免疫组化染色结果显示：VIP阳性细胞核着色为主，AQP3阳性反应细胞主要以胞浆和胞膜着色为主，呈棕黄色，胞核为蓝色。棕黄色即为阳性信号，在40×视野下，每组随机取12个视野，计数阳性细胞数，取均值。各组大鼠结肠免疫组化染色半定量分析差异均存在统计学意义。结果详见表2 ，图1-10。

表2 各组大鼠结肠组织中VIP、AQP3免疫组化染色半定量分析 ( n =12)

注：与空白组比较◆P<0.01；与模型组比较▲P<0.05，△P<0.01

4 讨 论 祖国医学认为便秘的基本病变属大肠传导失常，与脏腑功能失调密切相关。尤其是老年性便秘多以肾虚精亏为本，腑实燥结为标[1-2]。《诸病源候论》云: “……肾脏受邪，虚而不能制小便，则小便利，津液枯燥，肠胃干涩，故大便难。”因此我们参考《景岳全书》济川煎的组方，在张锡纯硝菔通结汤基础上加入肉苁蓉、当归，创立了硝菔通结方(肉苁蓉、当归、芒硝、莱菔)，该方温肾益精养血，软坚润肠通便，对功能性便秘标本兼治。方中芒硝咸寒泄热，软坚润肠通便，现代研究芒硝可显著增加小肠水分含量、稀释粪便，促进泻下，芒硝溶化或煎汁内服后，其硫酸钠的硫酸根离子被肠黏膜吸收，在肠道内形成高渗盐溶液，吸附大量水分，使肠道扩张，引起机械刺激，促进肠蠕动，从而发生排便效应。莱菔消食行滞，降气通便，文献报道莱菔子水煎剂可增强豚鼠体外胃窦环行肌条的收缩活动[3]； 莱菔子正己烷提取物有促进小鼠胃肠排空的作用；肉苁蓉温肾益精，润肠通便，现代研究发现肉苁蓉类药物的水煎剂具有明显的通便作用，可改善肠蠕动，抑制大肠的水分吸收，缩短排便时间[4]。当归归肝心脾经，性辛温，具有行走之性，功效补血活血，润肠通便。四药合用从而使肠道滋润，大便软化，促进排出。

功能性便秘与肠道水液代谢密切相关， VIP与AQP3是反映肠道水液代谢的相关指标[5]。VIP是肠神经系统中最具代表性和研究得最深入的神经递质，对胃肠运动有重要的调节作用，其受体广泛分布于人和动物的多种组织器官上。VIP 作为一种多效性作用的神经递质，具有扩张血管、降低血压的作用，对肠液的分泌具有很强的促进作用，对胃液的分泌可起抑制作用，对消化道平滑肌的收缩产生抑制作用[6]。AQP3属跨膜蛋白家族，主要分布于人类小肠和结肠的上皮细胞中，其所介导的自由水快速被动的跨生物膜转运是水进出细胞的主要途径，在消化道上皮细胞对水的吸收中起重要作用[7]。

本实验研究表明功能性便秘大鼠首粒黑便排出时间明显延长，粪便含水率、结肠含水率明显减少，结肠组织中VIP表达明显减少、AQP3表达明显增多，这与有关文献报道相一致。硝菔通结方治疗组，便秘大鼠的便秘症状明显改善，首粒黑便排出时间缩短，粪便含水率、结肠含水率明显升高，同时大鼠结肠组织中VIP表达增多，AQP3表达减少。提示硝菔通结方治疗功能性便秘的作用机制可能是通调节肠道水液代谢来实现。

[1] 王向春.苁明枳朴汤治疗顽固性便秘 40例[J].河 南 中 医,2012,9(32):1178-1179.

[2] 王淑杰，肖映昱，白 敏，等.归蓉益气调肠饮治疗老年功能性便秘 30 例[J].河 南 中 医,2013,6(33):926-927.

[3] 李海龙，李 梅，金 珊，等.菜菔子对豚鼠体外胃窦环行肌条收缩活动的影响[J]. 中国中西医结合消化杂志，2008，16(4)：215.

[4] 何俊堂，刘海峰，房殿春，等．慢传输型便秘大鼠结肠肌间神经丛内VIP 能神经、SP 能神经的免疫组化研究[J]．消化外科，2004，3(2) : 122-124.

[5] Ikarashi N, Kon R, Iizasa T, et al. Inhibition of aquaporin-3 water channel in the colon induces diarrhea[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin,2012,35(6):957-962.

[6] Abad C, Martinez C, et al. Therapeutic effects of vasoactive intestinal peptide in the trinitrobenzene sulfonic acid mice model of Crohn's disease. Gastroenterology. 2003;124(4):961-971.

[7] Matsuzaki T, Tajika Y, Ablimit A、 Aquaporins in the digestive system[J]. Med Electron Microsc.2004,37(2):71-80.

(收稿2014-06-11；修回2014-07-25)

*国家自然科学基金(81273663)

@硝菔通结方 功能性便秘 动物，实验 大鼠

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.03.056

国家课题重大专项(2012ZX09103201-037)

▲陕西中医学院(咸阳 712046)

△通讯作者:陕西省胃肠病证方药重点研究室(咸阳 712046)