不同肌肉特异性启动子IGF2表达载体构建及对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

孙晓丽，李树峰，佟慧丽，张伟伟，殷红艳，严云勤

(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)

不同肌肉特异性启动子IGF2表达载体构建及对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

孙晓丽，李树峰，佟慧丽，张伟伟，殷红艳，严云勤*

(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)

旨在获得带有高效特异性启动子的IGF2表达载体，研究其对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响。本研究将构建的3种含有IGF2肌肉特异性启动子的真核表达载体转染牛骨骼肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞，RT-PCR检测IGF2的相对表达量，从而筛选高效特异性的载体，并进行EdU试验及细胞周期相关基因RT-PCR检测。结果，成功构建了不同启动子desminpro、CMV-MyoGpro和MyoGpro-double表达IGF2的载体。RT-PCR检测结果表明，pGL3-desminpro-IGF2是较高效的并具有特异性的载体。载体转染体外培养细胞提高了细胞增殖速度，并上调了细胞周期相关基因CDK6和IGF2的表达。这为转基因肉牛的生产奠定了重要基础。

IGF2；肌肉特异性启动子；骨骼肌卫星细胞；细胞增殖

胰岛素样生长因子2 (Insulin-like growth factor 2，IGF2)是由67个氨基酸残基组成的蛋白质[1-2]，是骨骼肌生长发育的重要调控因子[3]，它调控细胞增殖、分化以及程序性细胞死亡，对个体生长和发育具有重要作用[4-5]。研究表明，与野生型小鼠相比，IGF2基因敲除小鼠的体重减少了40%[6]，S.Hayashi等得到了同样的研究结果，证明IGF2 在牛的骨骼肌再生过程中发挥着重要的作用[7]。近年来，对IGF2在促增殖方面的研究越来越多，但通过转基因方法探索IGF2对家畜肌肉生长影响的研究还较少。

为了提高外源基因在肌肉组织中的表达效率，启动子的选择是一个重要的因素。特异高效启动子可以驱动外源基因在真核细胞中表达[8]。目前，巨细胞病毒(CMV)启动子是外源基因在真核细胞中表达常选用的启动子之一，CMV启动子虽然高效但几乎没有细胞特异性，而且考虑到转基因的生物安全性，不能将其应用于转基因肉牛的生产中。本研究构建出3种含有肌肉特异性启动子的IGF2真核表达载体，通过细胞转染及IGF2表达量检测，筛选出具有较高活性和较强肌肉特异性的IGF2表达载体，使其能够促进肌肉细胞的增殖，为提高肌肉产量的转基因肉牛的生产提供重要帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株和载体 菌株DH5α、pMD18-T克隆载体购于大连TaKaRa生物技术有限公司；pcDNA3.1(+)，pMD18-T-desminpro，pMD18-T-CMV-MyoGpro pMD18-T-MyoGpro-double菌株由本实验室提供。1.1.2 工具酶、试剂盒和其他试剂 限制性内切酶和 LATaq 聚合酶等购于大连TaKaRa生物技术有限公司；Tissue DNA Kit I和Endo-Free PlasmidMini kit II购于Omega公司；Plasmid Mini Kit I和Gel Extraction Kit I购于北京TransGen生物技术有限公司；Trizol试剂购于 Invitrogen 公司；SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit II 购于大连TaKaRa生物技术有限公司；Cell-LightTMEdU Apllo 488InvitroKit购于广州锐博生物科技有限公司；蛋白胨、琼脂糖、酵母提取物、氯化钠等购自Sigma公司，DMEM、Opti-MEM、胎牛血清和马血清购自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 牛IGF2基因的克隆与测序 根据GenBank公布的牛IGF2基因序列AC_000186.1，设计IGF2引物，上游引物F:ccggaattcTCAATGGGGATCACAGCAGGAAAGT(小写部分为KpnⅠ酶切位点)；下游引物R:cccaagcttGCTCACTTCTAATCGCTGGATGCCT(小写部分为EcoRⅠ酶切位点)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以牛全基因组为模板扩增IGF2基因全序列。用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶回收试剂盒进行回收。回收PCR产物与PMD-18T克隆载体连接，双酶切鉴定正确后命名为pMD-18T-IGF2，送由北京英骏公司测序。

1.2.2 表达载体pcDNA3.1(+)-IGF2的构建 用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切获得目的片段，用同样的酶双酶切pcDNA3.1(+)载体，回收纯化后，用T4 DNA连接酶连接转化至DH5α感受态细胞中，挑选单克隆，提取质粒并酶切鉴定，成功构建pcDNA3.1(+)-IGF2载体。

1.2.3 pGL3-desminpro-IGF2、pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2、pGL3-MyoGpro-Double-IGF2 重组质粒的构建 用限制性内切酶NheⅠ和Hind Ⅲ分别双酶切pMD18-T-desminpro、pMD18-T-CMV-MyoGpro、pMD18-T-MyoGpro-double获得desminpro、CMV-MyoGpro、MyoGpro-double 3种肌肉特异性启动子，胶回收小片段，用同样的酶双酶切pcDNA3.1(+)-IGF2载体，用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞中，挑选单克隆，提取质粒并酶切鉴定，构建3种中间载体，然后用NheⅠ和XhoⅠ分别双酶切3个中间载体胶回收小片段，用同样的酶双酶切pGL3-Basic，用T4 DNA连接酶连接转化DH5α感受态细胞中，挑选单克隆，提取质粒并酶切鉴定，构建3种最终载体。

1.2.4 荧光定量RT-PCR检测相关基因的表达变化 Lipofectamine 2000 Reagent将构建3种重组质粒分别转染牛胎儿成纤维细胞和牛骨骼肌卫星细胞，同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。48 h后用TRIzol法提取各细胞总RNA，反转录后进行RT-PCR检测。分别检测IGF2、P27、CDK6基因mRNA相对表达量的变化情况，每个样品设置3个重复。RT-PCR扩增体系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA 2.0 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，无菌水补平体系至20 μL。RT-PCR反应条件： 95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，共45个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。引物序列见表1。

1.2.5 EdU检测 用Lipofectamine 2000 Reagent将pGL3-Basic和pGL3-desminpro-IGF2两种质粒转染接种于12孔板中细胞汇合度为90%的牛骨骼肌卫星细胞，48 h后，用EdU 试剂盒检测细胞增殖率。

表1 荧光定量引物序列及扩增长度

Table1 The sequences of qRT-PCR primers and the product length

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence扩增长度/bpProductlength退火温度/℃AnnealingtemperatureIGF2S:GCCTTCGCCTCGTGCTGCTAA:ACGGCTGCGTCGGTTTATGC14460P27S:GGCGTCAGACGTAAAA:CTTGGAGTCAGCGATA12149CDK6S:ATAAGCCAAGTTTCCCCAAGTGA:TGAGTGCTAAGGCAACCAGACA30258RPS18S:GTGGTGTTGAGGAAAGCAGACAA:TGATCACACGTTCCACCTCATC7960

1.2.6 统计分析 应用SPSS16.0软件包计算各组试验数据平均值、标准差及标准误差，并对各组试验数据之间的差异显著性进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 牛IGF2基因的克隆与中间载体pcDNA3.1(+)-IGF2的构建

以牛骨骼肌卫星细胞基因组DNA为模板，用IGF2引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，在相应位置出现明亮条带(图1)。测序结果分析表明，IGF2测序结果与GenBank发表序列的同源性为100%，表明成功扩增牛的IGF2基因。将pcDNA3.1(+)-IGF2重组质粒用KpnI和EcoR I进行双酶切鉴定，电泳结果显示，在5 428和551 bp左右处各有一条特异性条带(图1)，与预期结果相符。

2.2 不同启动子表达牛IGF2载体的构建与鉴定

pGL3-desminpro-IGF2、pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2 和pGL3-MyoGpro- Double-IGF2 3种重组质粒分别用NheⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，电泳结果显示，pGL3-desminpro-IGF2在4 818和851 bp处各有一条特异性条带，pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2在4 818和1 373 bp处有一条特异性条带，pGL3-MyoGpro- Double-IGF2在4 818 和1 090 bp处各有一条特异性条带(图1)，结果表明，3种肌肉特异性启动子和IGF2基因的CDS区成功连接到重组质粒中，与预期结果相符。

M．DNA相对分子质量标准DL5000；1．PCR扩增IGF2 CDS区结果；2．pcDNA3.1(+)-IGF2的Kpn I和EcoR I双酶切结果；3．pGL3-desminpro-IGF2的NheⅠ和XhoⅠ双酶切结果；4．pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2的NheⅠ和Xho Ⅰ双酶切结果；5．pGL3-MyoGpro- Double-IGF2的NheⅠ和XhoⅠ双酶切结果M．DL5000 marker；1． PCR product of IGF2 CDS；2．pcDNA3.1(+)-IGF2 plasmid digested with Kpn Ⅰ and EcoR Ⅰ；3．pGL3-desminpro-IGF2 plasmid digested with Nhe Ⅰ and Xho Ⅰ；4．pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2 plasmid digested with Nhe Ⅰ and Xho Ⅰ；5．pGL3-MyoGpro- Double-IGF2 plasmid digested with Nhe Ⅰ and Xho Ⅰ图1 PCR扩增结果和重组质粒的双酶切结果Fig.1 The result of PCR amplification and the recombinant plasmid by double digested with restriction enzymes

2.3 RT-PCR检测3种重组质粒转染细胞后IGF2的表达变化

将3种重组质粒转染牛骨骼肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞，同时设置pcDNA3.1(+)-IGF2为阳性对照，pGL3-Basic为阴性对照，control为空白对照，48 h以后收集细胞。荧光定量RT-PCR结果显示，pGL3-desminpro-IGF2组的IGF2的表达水平显著高于其他两组(P<0.05)，且具有较好的肌肉特异性(图2)，所以选择效果较好的pGL3-desminpro-IGF2质粒用于后续试验。

*.差异显著(P<0.05)；** .差异极显著(P<0.01)。图4、图5同*.Means differ significantly (P<0.05)；** .Means highly differ significantly (P<0.01).The same as Figure 4 and Figure 5图2 各组间IGF2 mRNA的相对表达量Fig.2 IGF2 relative expression in different groups

2.4 EdU检测转染pGL3-desminpro-IGF2后对细胞增殖的影响

重组质粒pGL3-desminpro-IGF2和对照组pGL3-Basic转染牛骨骼肌卫星细胞，48 h后用EdU试剂盒检测增殖变化(图3)，与对照组相比，转染pGL3-desminpro-IGF2后细胞增殖率为17.95%，转染pGL3-Basic后细胞增殖率为14.10%，pGL3-desminpro-IGF2与对照组相比增殖率为27.31%(图4)，结果表明pGL3-desminpro-IGF2能够促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。

2.5 RT-PCR检测转染pGL3-desminpro-IGF2后细胞周期相关基因的表达变化

用pGL3-desminpro-IGF2转染牛骨胳肌卫星细胞，48 h后，荧光定量RT-PCR检测IGF2、P27和CDK6的表达变化。与对照组比较，试验组细胞P27表达下降，而CDK6表达上升，差异均显著(P<0.05)(图5)。

3 讨 论

近年来，IGF2促进肌肉增殖的相关研究越来越受到关注，细胞试验证明，IGF2是肌细胞生长过程中的自分泌信号。A.Levinovitz等报道，在大鼠的骨骼肌再生过程中，IGF2 mRNA的表达水平显著上调[9]。IGF2对细胞生长的调控作用主要通过对细胞周期的调控实现。IGF2可以刺激DNA合成和细胞复制，推动细胞完成增殖周期[10-11]。本试验利用的是实验室前期构建的3种具有特异性且活性相对较高的3种启动子，Desminpro(300)是牛结蛋白基因大小为300 bp启动子，它活性较高，其启动基因表达的能力是人骨骼肌α-actin启动子和肌酸激酶启动子的2倍[12]；CMV-MyoGpro是MyoG基因启动子之前连接了一段CMV增强子序列，在C2C12细胞中CMV-MyoGpro复合启动子的转录活性较牛MyoG启动子而言提高了9倍左右，达到了强启动子CMV启动子的72%，相比牛骨骼肌卫星细胞，CMV增强子提高转录活性的效果更明显；MyoGpro-double 是含有两个拷贝数调控元件的MyoG启动子片段，其转录活性显著高于普通MyoG基因启动子，约为MyoG基因启动子转录活性的3.8倍[13]，3种启动子都具有较高的活性和较好的肌肉特异性[12-14]。本研究克隆了长度为551 bp牛IGF2基因的CDS序列，并构建出带有相应肌肉特异性启动子IGF2真核表达载体，即pGL3-desminpro-IGF2、pGL3-CMV-MyoGpro-IGF2和pGL3-MyoGpro-Double-IGF2。pGL3-desminpro-IGF2载体转染牛骨骼肌卫星细胞后能够高效特异性表达，且能够促进牛骨骼肌卫星细胞增殖。IGF2通过下调CDKs蛋白抑制因子P27的表达，上调CDK6的表达，加速细胞从G1期进入到S期的转变[15-16]，进而发挥其对牛骨骼肌卫星细胞的增殖作用。本研究通过荧光定量RT-PCR检测P27和CDK6的表达，结果显示，P27表达下降，而CDK6表达上升，均呈显著性差异(P<0.05)，这与文献报道一致。pGL3-desminpro-IGF2在牛骨骼肌卫星细胞中高效特异性表达，并促进成肌细胞的生长，推测其原因除了在desminpro肌肉特异性启动子的启动作用之外，IGF2的高表达在肌肉细胞生长方面发挥了重要的作用，因此该表达载体的应用能够为转基因肉牛的生产提供重要帮助。

细胞转染pGL3-Basic和pGL3-desminpro-IGF2，48 h后用EdU试剂盒检测增殖变化，绿色代表EdU阳性细胞，蓝色为DAPI染色的细胞核Cells transfected with pGL3-Basic and pGL3-desminpro-IGF2 were detected by EdU kit for proliferation changes，green is for EdU positive cells，blue is DAPI staining of nuclei图3 EdU增殖试验结果 200×Fig.3 Proliferation results of EdU 200×

图4 EdU阳性细胞百分率Fig.4 Percentage of EdU-positive cells

图5 各组间不同基因mRNA相对表达量Fig.5 Different genes relative expression in different groups

4 结 论

本研究获得了能够在牛骨骼肌卫星细胞中高效特异性表达的真核表达载体pGL3-desminpro-IGF2，其在牛骨骼肌卫星细胞的高效特异性表达，并促进成肌细胞的增殖。

[1] MICKE G C，SULLIVAN T M，MCMILLEN I C，et al.Protein intake during gestation affects postnatal bovine skeletal muscle growth and relative expression of IGF1，IGF1R，IGF2 and IGF2R[J].MolCellEndocrinol，2011，332(1)：234-241.

[2] 朱 婵，徐勇飞.IGF2 的生物学特性及其与疾病关系的研究进展[J].国际检验医学杂志，2010，(9)：966-969. ZHU C，XU Y F.Biological characteristics of IGF2 and Research progress of its relationship with disease [J].InternationalJournalofLaboratoryMedicine，2010，(9)：966-969.(in Chinese)

[3] GERRARD D E，OKAMURA C S，RANALLETTA M A，et al.Developmental expression and location of IGF-I and IGF-II mRNA and protein in skeletal muscle[J].JAnimSci，1998，76(4)：1004-1011.

[4] 彭凤兰.胰岛素样生长因子 2 (Igf2) 研究进展[J].实用预防医学，2008，14(6)：1963-1966. PENG F L.The research progress of insulin-like growth factor2 (Igf2) [J].PracticalPreventiveMedicine，2008，14(6)：1963-1966.(in Chinese)

[5] CONSTA^NCIA M，HEMBERGER M，HUGHES J，et al.Placental-specific IGF-II is a major modulator of placental and fetal growth[J].Nature，2002，417(6892)：945-948.

[6] DECHIARA T M，ROBERTSON E J，EFSTRATIADIS A.Parental imprinting of the mouse insulin-like growth factor II gene[J].Cell，1991，64(4)：849-859.

[7] HAYASHI S，ASO H，WATANABE K，et al.Sequence of IGF-I，IGFⅡ，and HGF expression in regenerating skeletal muscle [J].HistochemCellBiol，2004，122(5):427-434.

[8] 袁建龙，王 玮，金 永，等.人工合成启动子特异启动 IGF-1真核载体的构建与绵羊成纤维细胞转染[J].内蒙古大学学报：自然科学版，2010，41(6)：678-682. YUAN J L，WANG W，JIN Y，et al.The construction of synthetic promoter promote IGF-1 eukaryotic vector and transfected into sheep fibroblasts [J].InnerMongoliaUniversity：NaturalScience，2010，41(6)：678-682.(in Chinese)

[9] LEVINOVITZ A，JENNISCHE E，OLDFORS A，et al.Activation of insulin-like growth factor II expression during skeletal muscle regeneration in the rat：correlation with myotube formation[J].MolEndocrinol(Baltimore，Md.)，1992，6(8)：1227-1234.

[10] 李 聪，马凯丽，刘增力，等.IGFs 及其信号通路研究进展[J].生物技术通报，2013，(9)：43-46. LI C，MA K L，LIU Z L，et al.The research progress of IGFs and its signaling pathways [J].BiotechnologyBulletin，2013，(9)：43-46.(in Chinese)

[11] DUPONT J，KARAS M，LEROITH D.The potentiation of estrogen on insulin-like growth factor I action in MCF-7 human breast cancer cells includes cell cycle components[J].JBiolChem，2000，275(46)：35893-35901.

[12] 杜 巍，李树峰，佟慧丽，等.牛结蛋白基因启动子的克隆及功能的初步分析[J].畜牧兽医学报，2014，45(1)：56-61. DU W，LI S F，THONG H L，et al.Cloning and functional analysis of bovine desmin gene promoter[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2014，45(1)：56-61.(in Chinese)

[13] WANG X，LU M，FENG L H，et al.Effects of CMV enhancer on activity and specificity of bovineMyoGgene promoter[J].JNortheastAgricUniversity，2013，20(4)：34-38.

[14] 王秋华，曹允考，李树峰，等.牛MyoG基因启动子的克隆及功能的初步分析[J].畜牧兽医学报，2012，43(1)：37-43. WANG Q H，CAO Y K，LI S F，et al.Cloning and functional analysis of bovineMyoGgene promoter[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2012，43(1)：37-43.(in Chinese)

[15] DUPONT J，PIERRE A，FROMENT P，et al.The insulin-like growth factor axis in cell cycle progression[J].HormMetabRes，2003，35(11/12)：740-750.

[16] 董雅静.IGF2 真核表达载体的构建及绵羊骨骼肌细胞转基因研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2012. DONG Y J.The construction of IGF2 eukaryotic vector and the gene transfer in sheep skeletal muscle cells[D].Yangling：Northwest A&F University，2012.(in Chinese)

(编辑 郭云雁)

The Construction of Different Muscle-specific Promoter IGF2 Expression Vector and Its Impact on Bovine Skeletal Muscle Satellite Cell Proliferation

SUN Xiao-li，LI Shu-feng，TONG Hui-li，ZHANG Wei-wei，YIN Hong-yan，YAN Yun-qin*

(CollegeofLifeScience，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

The aim of this study was to construct IGF2 expression vector with efficient and specific promoter and study its effects on bovine skeletal muscle satellite cell proliferation.The 3 eukaryotic expression vectors containing IGF2 and muscle-specific promoter were transfected into bovine skeletal muscle satellite cells and fetal fibroblasts，the relative expression of IGF2 was detected by RT-PCR to screen efficient and specific vector.EdU experiments were carried out and RT-PCR was used to detect the cell cycle-related genes.The different promoter (desminpro，CMV-MyoGpro and MyoGpro-double) IGF2 expression vectors were constructed successfully.The test results of RT-PCR showed that pGL3-desminpro-IGF2 was an efficient and specific vector.The vector transfected into cultured cellinvitroincreased the speed of cell proliferation and up-regulated the expression of cell cycle-related genes，CDK6 andIGF2.The result has laid an important foundation for the production of transgenic bovine.

IGF2；muscle-specific promoter；skeletal muscle satellite cells；cell proliferation

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.007

2014-07-01

国家转基因专项“高产优质转基因肉牛新品种培育”(2011ZX08007-002)

孙晓丽(1988-)，黑龙江齐齐哈尔人，硕士，主要从事分子克隆与细胞增殖的研究，E-mail：965080867@qq.com

*通信作者：严云勤，教授，博士生导师，主要从事动物转基因的研究，E-mail：yanyunqin@sohu.com

S823；S813.3

A

0366-6964(2015)04-0555-06