新城疫疫苗毒和低致病性禽流感病毒感染SPF鸡炎症因子的变化

牛玉娟，马海营，张振东，吕传位，朱明霞，刘思当*

(1.山东农业大学，泰安 271018；2.聊城大学农学院，聊城 252059；3.山东凤祥股份有限公司，阳谷 252300)

新城疫疫苗毒和低致病性禽流感病毒感染SPF鸡炎症因子的变化

牛玉娟1，马海营1，张振东1，吕传位1，朱明霞2，3*，刘思当1*

(1.山东农业大学，泰安 271018；2.聊城大学农学院，聊城 252059；3.山东凤祥股份有限公司，阳谷 252300)

旨在探讨炎症因子(白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α)与气管黏膜分泌型免疫球蛋白A (SIgA)的变化是否可作为鸡呼吸道病的判定及预警指标。通过新城疫(ND)LaSota 疫苗毒和低致病性禽流感病毒(H9N2)单独及混合感染SPF雏鸡，造成呼吸道感染，采用双抗体夹心 ELISA 法对 SPF 鸡血清和气管冲洗液中炎症因子及SIgA的含量进行动态检测，分析其数量变化与呼吸道病症之间的内在联系。结果表明：ND LaSota 疫苗毒和低致病性禽流感 H9N2经呼吸道接种 SPF雏鸡后，会迅速出现呼吸道症状及炎症反应，炎症因子及黏膜抗体的含量较对照组显著升高；两病毒感染后引起的5种炎症因子含量的变化具有明显的时间差异；血清与气管冲洗液中炎症因子的变化大致相同，但是冲洗液5种炎症因子的含量变化更加敏感。所研究5种炎症因子的变化与鸡呼吸道感染的病程及病情均密切相关，借助炎症因子(尤其是IL-8)的检测有助于确定呼吸道炎症的发生及严重程度，对鸡呼吸道病的判定及预警具有重要的参考价值。

鸡；呼吸道疾病；炎症因子；诊断；预警

肉鸡呼吸道疾病严重危害肉鸡业的健康发展，在很多规模化鸡场，其造成的损失占整个疾病损失的一半以上。此病被称为多病因呼吸道疾病(multicausal respiratory disease，MRD) 或呼吸道综合征(respiratory syndrome)。鸡呼吸道疾病是在应激诱发因素作用下由众多病原微生物参与引起的炎性疾病，在病理上主要表现卡他性、出血性卡他性、纤维素性炎症，在其发生、发展过程中有众多炎症因子参与，局部黏膜抗体对炎症的发生发挥重要作用。

有研究报道检测血清中炎症因子的浓度，能帮助诊断某种特定病原造成的呼吸道感染性疾病，同时也能评估疾病的严重程度[1-9]。本课题拟通过检测白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)及气管黏膜分泌型免疫球蛋白A (SIgA)在呼吸道疾病发生过程中的动态定量变化，探讨5种炎症因子在呼吸道疾病中的产生及消长规律，分析其与鸡呼吸道疾病的相关性，为呼吸道疾病的诊断、预警及程度判定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF鸡胚，购自济南家禽研究所，孵化出壳后饲养至10日龄时进行试验。

1.1.2 病原 ND LaSota 株弱毒苗(1 000 羽份·瓶-1，NDV 的含量为 106.0EID50·羽份-1)，购自郑州康沃生物技术有限公司，批号(2010)160122007，按说明书稀释使用；H9N2低致病性禽流感病毒(106.0EID50·0.1 mL-1)由哈尔滨兽医研究所惠赠。

1.1.3 试剂 鸡的IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α及SIgA ELISA 试剂盒购自上海朗顿生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SPF鸡呼吸道感染方法 60羽10日龄SPF雏鸡随机分为4组(A、B、C、D)，每组15羽，A组以1×106EID50剂量的ND LaSota弱毒苗滴鼻，B组以106EID50·0.1 mL-1的H9N2 AIV滴鼻0.2 mL，C组按照A和B组的方法与剂量减半同时接种，D组为对照组接种灭菌 1%BSA-PBS 溶液。上述各组SPF鸡于负压隔离器内分笼饲养，自由采食和饮水。

1.2.2 临床症状观察 每天观察各组SPF鸡的临床症状，记录呼吸道感染情况。

1.2.3 血清和气管灌洗液采集 试验鸡于病毒接种后第1、2、3、4和6天，每组每次随机取3只SPF雏鸡，翅静脉采血1 mL，血凝后 3 000 r·min-1离心5 min，收集血清；取出整条气管，用止血钳夹住两端，然后将输液器末端的细软管插入气管喉头端，用5.0 mL冰冷的1%BSA-PBST溶液缓缓冲洗气管腔，并反复冲洗10次，获得的冲洗液经3 000 r·min-1离心5 min，取上清即为气管洗液，血清和灌洗液于-20 ℃冻存待检。

1.2.4 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α及SIgA含量检测 按照IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α及SIgA ELISA 检测试剂盒说明书操作，根据标准品数据在 Microsoft Office Excel 上拟合曲线，计算待测样品含量。

2 结 果

2.1 实验鸡的临床表现

由表1可见，A组第1天(24 h)有1只鸡出现呼吸道症状，表现为呼吸困难、呼吸啰音；第3天大都出现呼吸道症状(7/9)，但程度不同，有的表现为呼噜、咳嗽，呼吸啰音，有的表现呼吸困难、张口呼吸；之后症状鸡的数量有所下降，仍保持较高的比例(2/3)，症状与第3天相似；到第6天时剩余的3只鸡中有1只已无任何呼吸困难表现，另外2只的症状稍有缓和，仍在呼噜。B组出现呼吸道症状的时间较其他攻毒组晚，但发病鸡的比例在不断上升，到第6天有症状鸡达100%(3/3)。最初仅表现轻微的呼噜声，后期咳嗽，并见明显的呼吸啰音。C组也是24 h之后出现了呼吸道症状，随后症状鸡的比例持续上升，第6天时100%(3/3)的剩余鸡出现呼吸道症状，并见明显的咳嗽及张口呼吸。

2.2 试验鸡炎症因子含量检测与分析

2.2.1 血清炎症因子含量检测与分析 由表2可以看出，对照组的鸡血清中4种炎症因子的水平始终保持在一个相对稳定的范围内，变化幅度很小。

表1 试验鸡感染发病情况

Table 1 The result of infection of test chickens

组别Groupn鼻腔攻毒Nasalchallenge剂量/mLDose各时间点呼吸道症状鸡的比例Rateofchickenswithrespiratorysymptomsatvariouspoints第1天The1stday第2天The2ndday第3天The3rdday第4天The4thday第6天The6thdayA15LaSota弱毒苗0.21/153/127/94/62/3B15H9N2禽流感毒0.20/152/125/95/63/3C15H9N2+LaSota0.22/153/126/95/63/3D151%BSA-PBS0.20/150/120/90/60/3

pg·mL-1

*.显著差异(P<0.05)，下表同

*.P<0.05，the same as below

3个攻毒组在第1天，4种炎症因子的含量均有所升高，除A组IL-6的含量较对照组显著升高(P<0.05)外，均差异不显著；在第3天4种炎症因子含量均达到高峰，之后均呈下降趋势，含量仍高于对照组。IL-1的含量A组在攻毒后第2、3和4天时显著高于对照组(P<0.05)；B组在攻毒后第3、4和6天显著高于对照组(P<0.05)；而C组只在第3天时显著高于对照组(P<0.05)。IL-6的含量A组在攻毒后第1、2、3和4天时显著高于对照组(P<0.05)；B组在攻毒后第3、4和6天显著高于对照组(P<0.05)；C组与B组相似。IL-8的含量A组和C组在攻毒后第2、4和6天时显著高于对照组(P<0.05)，B组则在第2、3和4天时显著高于对照组(P<0.05)。TNF-α的含量A组在攻毒后第2、3天时显著高于对照组(P<0.05)，B组和C组在攻毒后第3天显著增高(P<0.05)。A组4种炎症因子显著升高的时间大都早于B组和C组。

2.2.2 气管灌洗液炎症因子含量检测与分析 由表3可以看出，各试验组病毒感染第1天检测，气管灌洗液 IL-1、IL-6、IL-8 及TNF-α含量均明显升高，SIgA在前4 d与对照组没有区别，6 d时含量突然升高。血清和气管灌洗液中IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α变化规律基本相同，在感染后第3 天炎症因子的表达量最高。但与血清相比气管灌洗液炎症因子的变化更加迅速。对照组气管灌洗液中炎症因子和黏膜抗体含量很低，不在试剂盒检测范围之内。

pg·mL-1

-.未检出

-.Not detected

2.2.3 血清与气管灌洗液中炎症因子的比较 血清与气管灌洗液中炎症因子的比较结果显示，血清中炎症因子的水平通常比气管灌洗液的水平低，但两者的变化规律基本相似(图1)。

图1 血清和气管灌洗液中IL-1的含量比较Fig.1 Comparison of the factors IL-1 in serum and bronchoalveolar lavage fluid

3 讨 论

自然条件下，鸡群人工感染低致病性禽流感(H9N2)病毒或者接种LaSota疫苗毒通常不会引起鸡群明显发病，而该试验接种SPF雏鸡后迅速出现呼吸道症状，这可能与SPF雏鸡无母源抗体保护有关。SPF鸡对低致病性禽流感病毒和LaSota疫苗毒高度敏感，便于临床症状的观察，为鸡呼吸道病模型的建立以及探究炎症因子与呼吸道病症的内在联系奠定了良好的基础。

LaSota 疫苗毒进入 SPF 雏鸡体内后24 h内就有呼吸道症状出现，说明LaSota疫苗毒对于 SPF雏鸡具有一定的致病性。疫苗毒引起的呼吸道病发病急、病程短；H9N2禽流感病毒感染则发病缓、病程长；混合感染组发病急且病程长，兼有两者之特点，提示在生产实践中，倘若鸡群中存在 H9N2 禽流感病毒隐性感染，当用 ND 疫苗免疫时，可能会使鸡群暴发呼吸道疾病。

各试验组血清和气管灌洗液中IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的含量当天就有明显升高，在第3天均达高峰，与一些研究结果[10-11]类似。炎症因子的变化较呼吸道症状出现得早、规律性强、便于量化检测，因而炎症因子可作为呼吸道感染早期的判定指标，据变化的量化指标可以推测炎症的反应程度。研究发现4种因子水平呈正相关，表明在病毒感染性炎症的过程中IL-8、IL-6、IL-1及TNF-α协同发挥生物学效应，跟其他研究结果一致[12]。综合4种炎症因子的变化，IL-6和IL-8在呼吸道感染过程中变化最为显著、相关性最强。

鸡体对抗NDV和H9N2感染的免疫应答在内容上可分为体液和细胞免疫，在方式上可分为全身免疫和局部免疫。他们一方面以其特有的方式参与免疫应答反应，另一方面又协同发挥作用。最初免疫反应主要发生于感染局部的黏膜。病毒侵入呼吸道黏膜后首先被巨噬细胞为主的抗原递呈细胞捕获，一方面对其加工处理、浓集抗原决定簇于细胞表面；另一方面释放出IL-1，激活的Th细胞(CD4+T细胞亚群)，分泌释放多种炎症因子参与细胞免疫并促进体液免疫。另外，具有一定毒力的病毒感染导致的黏膜局部炎症或全身性炎症反应，也会导致上述炎症因子的大量产生。试验结果表明，SIgA的升高远晚于4种炎症因子的升高，他人的研究报道也得出了类似的结果[14-15]。

通过ELISA方法检测炎症因子的变化，灵敏度高，操作简单，能定量反映炎症变化，炎症因子变化的时间远早于临床表现、病理变化及免疫抗体的产生，是判定呼吸道炎症反应的重要指标。可以运用此方法对鸡群呼吸道炎症的变化进行动态监测，炎症因子的变化幅度较大时，意味着可能即将发生严重的呼吸道炎症，应引起高度重视，具有重要的警示作用。但是此方法也有不足之处：1)炎症因子的变化没有特异性，不能具体判定是何种病原导致的炎症反应；2)血清中的炎症因子是全身性炎症的综合表现，无法定位炎症部位；3)黏膜抗体含量的高低不能反映呼吸道感染的严重性。

4 结 论

初步证明IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和SIgA 5种炎症因子的变化与鸡呼吸道感染的病程及病情均密切相关，借助炎症因子尤其是IL-8的检测可有助于确定呼吸道炎症的发生及严重程度，对鸡呼吸道病的判定及预后具有重要价值。

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(编辑 白永平)

The Changes of Inflammatory Factors in SPF Chicken infected by LaSota live Vaccine and H9N2 Influenza Virus

NIU Yu-juan1，MA Hai-ying1，ZHANG Zhen-dong1，LÜ Chuan-wei1，ZHU Ming-xia2，3*，LIU Si-dang1*

(1.ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China；2.AgriculturalCollegeofLiaochengUniversity，Liaocheng252059，China；3.ShandongFengxiangGroupLimitedLiabilityCompany，Yanggu252300，China)

The aim of the present study was to investigate if the changes of inflammatory cytokines (interleukin 1，interleukin 6，interleukin 8，tumor necrosis factor alpha) and tracheal washing liquid and trachea mucosal secretory immunglobulin A (SIgA) can be used as judgments or warning indicators of respiratory diseases.We established a respiratory diseases model by infecting SPF chickens with Newcastle disease LaSota live vaccine and low pathogenic influenza virus (H9N2) single or mixed.Inflammatory factors of serum and SIgA were measured by double antibody sandwich ELISA method to analyze the inner relationship between the quantity changes and respiratory diseases.The results showed that SPF chickens appeared respiratory symptoms after inoculating LaSota vaccine and H9N2 AIV，content of inflammatory factors and mucosal antibody became significantly higher than those in control group，the changes of five cytokines content induced by two viral infection had obvious differences with time going，inflammation mediums became roughly same while the content in serum were less than in washing liquid.Pathological changes of chicken respiratory tract infection were closely related to the changing process of five inflammatory factors.With the help of detection of inflammatory factors，especially the IL-8，the severity of respiratory tract inflammation could be identified，so the detection of its content would have important reference value for the judgment of respiratory illness and early warning.

chicken；respiratory diseases；inflammatory factors；diagnosis；prediction

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.019

2014-07-31

山东省高等学校科技计划项目(J14LF03)；博士后自选课题

牛玉娟(1989-)，女，山东济宁人，硕士生，主要从事病理学研究，E-mail:yujuanniu@163.com

*通信作者：朱明霞，E-mail：1538054669@qq.com；刘思当，E-mail：liusid@sdau.edu.cn

S852.4

A

0366-6964(2015)04-0644-06