酒精性肝纤维化中主要信号转导通路的研究

姜艳红 张维东

酒精性肝病（ALD）是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝，进而可进展为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化（ALF）、酒精性肝硬化甚至可引起肝功能衰竭。ALD的进展过程中，乙醇在体内代谢通过多个环节产生氧自由基（ROS），ROS作用于生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化形成过氧化脂（LPO），LPO可通过诱导炎性细胞浸润而诱导HSC活化增殖。乙醛是乙醇的中间代谢物，能触发多种复杂的反应，可以使细胞基质分泌增多并激活HSC，从而导致ALF的发生。因ALF早期具有可逆转的特点，所以对发生机制的深入研究一直是近年来的热点。

研究表明，HSC的活化和增殖在肝纤维化的发生过程中起着关键作用［1］，活化的HSC表达多种细胞外信号通路蛋白，产生以胶原为主的细胞外基质（ECM）和细胞因子。HSC活化的标志物包括平滑肌肌动蛋白-α（α-SMA）、原胶原Ⅰ、转化生长因子-β1（TGF-β1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）和组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）等。经过乙醛处理后，胶原蛋白Ⅰ的合成增加，而在HSC中其降解减少，在肝脏中的胶原蛋白和胶原蛋白基因产生高效表达。有研究表明，早期依赖乙醛的反应可引发后期的肝纤维化［2］。

了解参与HSC活化增殖凋亡的相关细胞因子介导的信号转导通路可为逆转ALF提供有效的靶向。本文简要综述了ALF主要的细胞信号转导通路。

1 TGF-β／Smads信号转导通路

TGF-β是一种参与细胞存活、增殖、分化、血管生成和伤口愈合应答的多效性细胞因子［3-4］。在哺乳动物中发现有 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2四个亚型。许多细胞表面都有TGF-β受体（TGF-βR）表达，其具有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种形式。TGF-βRⅠ、Ⅱ型均为糖蛋白，它们与 TGF-β1的亲和力是与TGF-β2的亲和力的10～80倍，Ⅲ型受体则是一种与 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三者的亲和力相近的蛋白聚糖，是TGF-β主要的受体，可能在TGF-β发挥生物学功能中起着重要作用。TGF-βRⅢ的主要配体是 TGF-β1和 TGF-β3。

Smads蛋白家族在将TGF-β信号从细胞表面受体转导至细胞核的过程中起着主要作用，在保守的结构域MH1和MH2之间有中间连接区域。每个Smad蛋白介导不同的TGF-β家族成员的信号转导。Smad2和Smad3参与TGF-β活化素信号途径，Smad4的MH1结构域具有转录激活和定位功能，而Smad6和Smad7是TGF-β／Smads信号通路的抑制分子。在Smad蛋白依赖的信号中，TGF-β1和Ras相关激酶使Smad2和Smad3差异磷酸化，从而建立羧基末端（C）、链接器（L）或双重（L／C）磷酸化异构体，磷酸化的Smad2、Smad3与Smad4基因移位到细胞核内，激活或抑制它们所调节的靶基因的转录。

研究表明，细胞凋亡、免疫清除、表型逆转和细胞衰老参与清除活化的HSC或抑制HSC激活，可以逆转肝纤维化［5］。慢性肝病中TGF-β通过炎性反应促进纤维发生，是较有力的促进因素［6-7］。HSC的激活和纤维化的进展与 TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3a、Smad3b等表达上调有关［8］。在小鼠和大鼠的HSC中采用细胞增殖和凋亡检测以及RT-PCR、蛋白质印迹法分析、免疫组化染色、流式细胞技术等方法，结果发现TGF-β1上调血小板衍生生长因子-β（PDGF-β）受体mRNA的表达并明显诱导HSC增殖，且依赖TGF-β1的HSC增殖是由过氧化氢酶抑制的过氧化氢作用的，即PDGF-β受体通过激活PI3K／AKT／P70（S6K）信号通路影响TGF-β1的作用并通过 ROS介导［9］。Tang等［10］体外实验发现，鳖甲提取肽（CTEP）可影响TGF-β1诱导的HSC，应用MTS试验、酶联免疫吸附试验和免疫印迹法可知，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TIMP-1的含量显著被抑制，经CTEP处理后Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、p-Smad3、TIMP-1和α-SMA的蛋白显著降低，而Smad3蛋白的差异没有统计学意义。提示通过TGF-β1／Smads通路以及消除ECM能有效抑制培养的HSC-T6细胞的活化和增殖。在肝纤维化中TGF-β／Smads信号通路的作用机制已较明确，而此通路在ALF中同样发挥着重要的作用。有研究发现乙醛可以使HSC中的TGF-β信号通路激活，TGF-β1抑制肝实质细胞增殖，促进Ⅰ型胶原蛋白及纤维黏连素增加，导致HSC增殖并转分化，而TGF-β信号可以通过下调乙醇脱氢酶1增加肝脏脂质的堆积［11］。也有研究发现，TGF-β1可以作用于ROS生成和钙内流，而这两者是调节HSC的活化剂。TGF-β1介导氧化应激引起HSC的转分化，为ECM沉积和疤痕收缩做好准备，致使ECM和Ⅰ型胶原蛋白产生。从桑黄菌丝体中分离出的一种视黄酸衍生物可下调TGF-β1／PDGF刺激的HSCT6细胞中ROS生成和钙内流，逆转早期肝纤维化［12-13］。Smad7是TGF-β信号通路的细胞内的负调节物，在乙醇引起的肝损伤过程中，调控脂肪生成和炎性反应发生的关键基因表达上调，肌成纤维细胞中TGF-β能传递引起纤维化的pSmad2 L／C与促有丝分裂的pSmad3 L信号，因为Smad7不能被pSmad3 L信号途径诱导，Smad7缺失加剧，缺乏Smad7的肝细胞里TGF-β诱导的上皮间质转化加快且乙醇脱氢酶表达显著降低，缺少Smad7可能导致 ALF加速［14-15］。

2 Wnt／β-catenin信号转导通路

Wnt是一类通过自分泌或旁分泌发挥作用的糖蛋白，目前研究发现主要有 Wnt1、Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a等19种蛋白。其信号通路的核心蛋白为一种多功能的蛋白质β-连环蛋白（β-catenin），在细胞连接处与钙黏素相互作用而形成粘合带。游离的β-catenin能进入细胞核参与基因表达。β-catenin降解复合体主要由结肠腺瘤性息肉病（APC）基因蛋白、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、支架蛋白Axin组成。Wnt信号通路包括Wnt经典信号通路和Wnt非经典信号通路。经典途径受到激活后，胞外的 Wnt蛋白与其细胞表面受体Frizzled以及LRP跨膜受体结合成复合体，通过活化的蓬乱蛋白（Disheveled，又称Dsh或Dvl）激活下游因子GSK-3β结合蛋白（GBP），GBP识别并抑制GSK-3β的活性，从而影响β-catenin丝氨酸及苏氨酸的磷酸化及降解，阻止β-catenin降解复合体的形成，导致β-catenin在胞浆内蓄积并进入核内，与转录因子LEF／TCF结合形成转录复合物，激活某些特定基因的表达［16-18］。

Wnt／β-catenin信号通路与TGF-β信号通路、miRNA之间在参与肺纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化和肾纤维化等各器官相关的致病作用中存在着信号串话［19］。激活HSC后，Wnt信号途径中某些元素被上调［20］。但是此通路在ALF中的作用机制目前还未被完全阐明。有研究发现，在ALF中利用肌成纤维细胞基于Cre-loxP的遗传标志物，在肝纤维化复原过程中，半数肌成纤维细胞逃避凋亡，下调形成纤维化的基因，并获得一个类似的表型，但不同于静止态的HSC，在促纤维化刺激中能更迅速地重新活化成肌纤维母细胞，并且强有力地促进肝纤维化的形成［21］。活化的HSC内β-catenin的表达水平是静止态HSC的5～7倍，当β-catenin的作用受到阻断时HSC的活性也被抑制，而乙醛刺激大鼠的HSC使β-catenin表达明显增加。Sept4蛋白只在静止态的HSC内表达，HSC通过损失Sept4蛋白后促纤维化转化，在某种程度上由于DKK2和同系物的表达减少，解除了经典Wnt通路的抑制，而DKK2的单苷酸多态性（SNP）与乙醇损害相关［22-23］。在 体 外 培 养 的 HSC 中，TGF-β1 通 过（ERK1／2）／GSK-3轴促进β-catenin的表达并增加β-catenin的蛋白稳定性，经由β-catenin通路下调过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）的表达活性而达到增加α1胶原蛋白的水平［24］。在大鼠的酒精性肝病模型中，研究发现增加肝细胞的增殖，视黄醇及视黄酸存储耗竭，β-catenin和磷酸化的GSK-3β胞质和核表达增加，Wnt7a mRNA和几种β-catenin的目标蛋白包括谷氨酰胺合成酶、细胞周期蛋白D1、Wnt1诱导的信号通路蛋白及基质金属蛋白酶7的表达显著上调。以上研究表明在乙醇引起的慢性肝脏疾病中，Wnt／β-catenin信号转导途径可被激活［25］。但也有研究发现，乙醛引起的α2Ⅰ型胶原蛋白mRNA和Wnt蛋白的表达水平是独立的，因为DKK1没有阻止这些诱导。β-catenin的小抑制RNA显著下调新鲜分离的HSC中致纤维化基因的表达，在核氧化还原蛋白过度表达的HSC中β-catenin的核移位受抑制，乙醛增加磷酸化的GSK-3β蛋白并刺激β-catenin的核移位，还增加了细胞内的活性氧水平。稳定的β-catenin移位至细胞核内，调节致纤维发生的通路基因［26］。因此，需深入了解 Wnt／β-catenin信号通路的作用机制，为有效逆转ALF提供治疗靶点。

3 NF-κB信号转导通路

核转 录 因 子-κB（NF-κB）家 族 由 NF-κB1、NF-κB2、cRel、Rel-A和 Rel-B组成。这些蛋白质任意两者之间可以形成同源或异源二聚体，二聚化后形成有活性的NF-κB，但其中Rel-B只能与NF-κB1或者NF-κB2有效结合。它们都有一个Rel同源结构域，是由300个氨基酸组成的氨基末端。IκB是NF-κB的强抑制蛋白，有IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBδ、IκBε五个抑制分子。它们都有两个N末端丝氨酸残基、多个与降解有关的C端脯-谷-丝-苏序列和锚蛋白重复序列，Rel同源区调控锚蛋白重复序列与NF-κB的相互作用。在未受刺激的细胞中NF-κB二聚体通过与细胞质中IκBα、IκBβ、IκBε三个抑制因子其中之一结合而呈现无活性状态。各种信号通过使IκB蛋白磷酸化、泛素化，进而被蛋白酶体降解的方式来活化NF-κB，活化的NF-κB进入细胞核内与DNA结合来诱导靶基因的转录。NF-κB在炎性反应、免疫应答、细胞增殖、细胞凋亡和肿瘤等重要生理病理过程中发挥着重要作用。NF-κB能够被脂质过氧化产物、内毒素等激活，调节包括结缔组织生长因子（CTGF）等多种基因的表达，从而呈现NF-κB的核转位活性，促进成纤维细胞增生分化，参与肝纤维化的形成。

许多细胞因子在基因水平上都受到NF-κB的调控，在肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素（IL）等细胞因子的启动子上都有NF-κB的结合位点。在病毒性肝炎、酒精性肝病、肝纤维化、肝脏肿瘤等多种肝脏损伤及疾病中都伴有NF-κB活性的改变。当细胞受到氧化应激、免疫刺激剂、细菌病毒、乙醇、氧自由基和细胞因子等刺激时，被激活的NF-κB和磷酸化的IκB-α含量增高，通过影响炎性因子TNF-α、IL-6的表达和分泌启动免疫炎性反应等多种损伤基因的转录，增强翻译过程，参与肝损伤的发生发展。NF-κB2可以促进ECM增多并积聚，导致HSC活化，实验证明NF-κB活化和CTGF与ALF的严重程度有密切关系。孙屹峰等［27］用参芪扶正注射液治疗乙醇灌胃诱导的肝纤维化大鼠，发现其能显著降低肝纤维化大鼠NF-κB及CTGF mRNA的表达，降低肝纤维化的进展程度。提示抑制NF-κB的活化，下调CTGF的表达可以防治并逆转肝纤维化。紫铆通过NF-κB、JNK、p38促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路介导乙醇诱导的HSC的细胞内信号，可抑制由乙醇或乙醛诱导的ROS产生和HSC的迁移，从而减少乙醇的毒性，下调TGF-β、TIMP-1和TIMP-2的表达，降低 MMP-2的活性，增加MMP-13的活性，抑制p38 MAPK和JNK信号转导途径的激活，并显著抑制NF-κB的抑制剂IκB和Smad3的磷酸化［28］。小鼠酒精性肝细胞损伤过程中，NF-κB通路被激活，且NF-κB、炎性因子、趋化因子等多种因子表达增高，NF-κB的激活促进HSC的增殖，减少HSC的凋亡，并且可以促进胶原蛋白的生成，引起肝组织发生炎性反应、纤维化、坏死和凋亡［29］。而乙醛处理HSC后胞质中IκB的含量显著下降，乙醛可以使IκB降解，使其对NF-κB的抑制降低，促进 NF-κB的核转移。但究竟是 HSC的活化影响了NF-κB，还是NF-κB的激活介导了HSC的活化，迄今为止还没有相关文献报道。

4 小结

综上所述，HSC活化、增殖和凋亡所涉及的调节信号转导网络系统繁多，TGF-β／Smads通路、Wnt／β-catenin通路和NF-κB通路彼此之间联系错综复杂，共同介导着ALF的发生发展，了解掌握彼此的关联对逆转纤维化有着至关重要的作用。以酒精性肝病传统治疗为基础，通过干预各信号介导途径，建立干预HSC激活凋亡的分子治疗靶点可以有效达到治疗目的。然而，各个通路的作用机制及其相互联系目前尚不明确，需要更深入的研究剖析在HSC中的多条信号通路发挥的作用和联系，才能有望彻底逆转肝纤维化。

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