间充质干细胞治疗晚期脂肪性肝病的研究进展

陈 怡

肝病至今仍是五大致死性疾病之一，其中脂肪性肝病现已取代病毒性肝病成为全球第一大类肝病，由脂肪性肝病发展为肝硬化或重症肝病的患者不断增多。无论急性或慢性脂肪性肝病、酒精性或非酒精性脂肪性肝病、营养不良性或营养过剩性脂肪性肝病，均可引起大量肝细胞坏死，出现肝纤维化，最后导致不可逆的肝衰竭。而且脂肪性肝病早期多无临床症状，易被忽视，晚期只能行肝移植。由于肝移植器官来源紧缺、有免疫排斥、费用昂贵且涉及伦理道德，故肝移植的普及是很困难的。利用间充质干细胞的高度增殖和分化潜能，细胞治疗作为一种替代治疗手段应运而生［1］。间充质干细胞来源广泛，由于会导致肿瘤，其临床应用受到严格限制［2］，外源性骨髓［3］、脂肪［4］、脐血［5］是常用的细胞治疗用间充质干细胞的来源。本文着重阐述不同来源的间充质干细胞分化诱导成类肝细胞以治疗晚期脂肪性肝病的研究进展。

1 间充质干细胞的来源和治疗潜能

1.1 骨髓来源的间充质干细胞

骨髓来源的间充质干细胞（BMSC）来源于中胚层，具有自我复制、高度增殖和多向分化潜能，能够被定向分化诱导为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、韧带和肌细胞谱系［6］。BMSC表面阳性表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49e、CD51、CD54、CD59、CD71，不表达 CD34、CD45、CD14、CD79。有动物实验发现，BMSC与表皮生长因子-4（EGF-4）、EGF-1α、肝细胞生长因子（HGF）及CK18等培养7 d后，BMSC表达了肝细胞核因子-3β（HNF-3β，FOXA2）、GATA4、CK19、转甲状腺素蛋白、AFP；14～28 d后，表达CK18、HNF-4、EGF-1α的细胞都表现出肝细胞的结构特征，能分泌尿素、白蛋白和细胞色素P450，产生低密度脂蛋白和储存糖原［7］。因此，BMSC是一种理想的肝损伤和生物人工肝治疗的干细胞来源。

1.2 脂肪来源的间充质干细胞

脂肪干细胞（ADSC）是来源于脂肪，具有自我更新和分化诱导能力，并呈现出干细胞特征的一群细胞。由于其来源易得，在体外有可能增殖成许多自体同源细胞，因此其用于细胞治疗和组织工程受到广泛关注。ADSC与BMSC的表面标志物表达相同、增殖潜能相似并可能前者更好［8］。

1.3 脐血来源的间充质干细胞

脐血干细胞来源于脐血，其许多成分是多能干细胞，表面标志物表达与BMSC相同，能分化产生不同类型的细胞。此外，脐血干细胞也表达胚胎干细胞的表面标志物，如 Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA-1、SSEA-4、OCT-4［9］。因其低水平表达人类白细胞抗原-ABC（HLA-ABC），不表达 HLA-DR，分泌的分子能诱导自然杀伤（NK）细胞，并能抑制T细胞分泌转化生长因子-β（TGF-β）和干扰素-γ（IFN-γ）［10］，因此脐血干细胞能够从内胚层、中胚层直到外胚层进行扩展。

脐血干细胞首先被从其他干细胞中分离鉴定出来，它们表达干细胞的受体CD44、CD105、CD90和CD73［11］，但不表达造血干细胞的标志物CD31、CD34、HLA-DR和CD45，而且它们能分化成心肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛样细胞和神经样细胞。

有研究指出，肝外的间充质干细胞能够采用2D或3D的肝细胞共培养方式，通过外援性生长因子的刺激诱导为肝细胞［12］。Zhang等［13］用两步法将脐血干细胞诱导分化为肝细胞，采用的肝细胞生长因子包括HGF、成纤维细胞生长因子（bFGF）、地塞米松、胰岛素等。

上述研究表明，在合适的外环境和条件下，间充质干细胞能够分化为肝细胞，是晚期脂肪性肝病细胞治疗和肝脏组织工程的有效来源，而不同来源的干细胞具有不同的功能［14］，在小鼠模型和人类的应用中都值得作进一步研究。

2 脂肪肝的肝损伤及间充质干细胞修复的机制

酒精性肝病和非酒精性肝病是根据每日饮酒量来划分的［15］，最终的结果都是导致肝纤维化和肝损伤。在酒精性脂肪性肝病中，乙醇可使肝细胞发生很大的改变，包括质膜、线粒体和细胞核［16］。在质膜中，乙醇可增加膜的通透性，诱导膜缺陷发生，引起磷脂的数量增加，增加膜表面电荷密度和脂质过氧化产物；特别是最近鉴定出了包括annexin A3和annexin A6在内的5种蛋白可作为乙醇导致肝硬化的相关生物标志物。在高脂饮食小鼠模型中，高脂饮食可引起三酰甘油和胆固醇升高，导致血脂异常、脂质过氧化和肝星状细胞的激活，最终导致肝脂肪变［17］。肝细胞的胰岛素抵抗，更加速了炎性反应的进程。

研究表明，干细胞转变为肝细胞主要是通过两种可能的机制：转移分化和细胞融合［18］。首先，在间充质干细胞被注射入肝脏后，发生同型转变，表达类肝细胞的基因型，完成肝细胞类似的新陈代谢功能表达。但只有8%～23%的间充质干细胞实现了向肝细胞的定向分化［19］，其机制不明。其次，肝损伤与免疫细胞浸润引起的持续性炎性反应有关［20］，而间充质干细胞有免疫诱导特性，能分泌抗炎因子，下调T细胞、B细胞及单核细胞浸润［21］。再次，输注间充质干细胞可降低血小板衍生因子-BB（PDGF-BB）、TGF-β1，出现胶原蛋白减少，表达基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、MMP-13、MMP-14等，激活溶酶原激活因子，实现肝纤维化的逆转［22］。最后，移植间充质干细胞可导致肝星状细胞凋亡，并通过分泌肝损伤修复过程中的生长因子和细胞因子来促进肝细胞增殖，最终促进已纤维化的肝脏容量提升。

3 间充质干细胞修复肝脏的应用现状

有关间充质干细胞治疗晚期脂肪性肝病的研究不多。Kharaziha等［23］对包括酒精性肝病在内的8例终末期肝病患者进行间充质干细胞治疗。先从患者髂嵴处抽取脂肪进行体外培养增殖自体间充质干细胞，再通过外周静脉和门静脉输注3×108～5×108干细胞，分别于注射后第1、2、4、8及24周评估疗效。结果显示，患者对间充质干细胞移植耐受，MELD 评分指数从（17.9±5.6）下降到（10.7±6.3）（P＜0.05），凝血酶原复合物指数从（1.9±0.4）下降到（1.4±0.5）（P＜0.05），血清肌酸酐从（114±35）mmol／L下降到（80±18）mmol／L（P＜0.05），血清白蛋白从（30±5）g／L上升到（33±5）g／L，胆红素从（46±29）mmol／L下降到（41±31）mmol／L，没有任何不良反应发生。

用BMSC和ADSC治疗非酒精性脂肪性肝病的具体操作方法已有报道［24］。Pelz等［25］对蛋氨酸／胆碱缺陷饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型输注干细胞，结果移植后短期和长期的疗效观察都显示间充质干细胞能在肝内定居并表现出肝细胞功能。

在用间充质干细胞治疗时，通常不需要考虑免疫配型、组织相容性抗原（MHC）的匹配和防止免疫拮抗反应等问题。由于间充质干细胞不含MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及共刺激分子CD80、CD86和CD40，不会引起同型T细胞反应，间充质干细胞不是宿主免疫识别的对象［26］，因此其能免受宿主免疫细胞的攻击。有研究报道小鼠经间充质干细胞治疗后，抗炎因子白细胞介素-10（IL-10）、IL-15受体等上调，促炎因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6等下调［27］。

在骨髓、脂肪、脐血等来源的间充质干细胞注射入肝脏后，可通过血清胆红素、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平对效果进行临床评估［28］。Kuo等［29］的研究认为，经脾注射和经静脉注射都有助于肝细胞增加及肝脏修复，但后者比前者更有效，受体的氧化应激反应减轻能促进肝损伤后肝细胞的复原，提示有旁分泌作用的影响。Adriana等［28］的研究分别将BMSC和安慰剂由门静脉注入用四氯化碳（CCl4）损伤的肝脏中，检测ALT、AST和白蛋白水平，发现BMSC并不能减轻纤维化、改善肝功能。由于大部分数据来自小样本非随机对照研究，故需进一步的研究以确定在终末期肝硬化患者中，细胞疗法的作用以及哪种类型患者应用细胞治疗的效果最好，哪种细胞类型治疗最安全有效。

4 展望

采用MSC治疗脂肪性肝病引起的肝损伤的优势是：避免了伦理之争；移植痛苦小，不良反应少，不易引起感染；病程较短，从采集到干细胞培养、纯化，再到回输至患者体内，只需要很短的时间；间充质干细胞移植费用比肝移植低很多；有一定的疗效，安全性高，避免了异体移植引起的感染和肿瘤形成风险，避免了异体基因引起的遗传病和异体蛋白所致免疫排斥反应。

目前间充质干细胞的治疗研究仍是初步的，许多问题亟需解决，包括注入的细胞数量、成分、剂量，移植的最佳时机及治疗的管理方式等。同时，如何保持间充质干细胞体外扩增后的特性，间充质干细胞的免疫调节和免疫抑制是通过哪些途径来实现的，怎样能避免间充质干细胞移植后修复肝损伤的不良作用，都将是今后需要研究的方向。此外，通过建立患者自体骨髓库、羊水干细胞库及自体脂肪体外培养的方法，找到安全、有效、易得的干细胞来源，并实现自体细胞移植，将大大拓展脂肪性肝病所致的晚期肝损伤的治疗方法。

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