一株抗菌活性物质产生细菌的分离及鉴定

殷杰+王蒙+曾小波+马志勇+程国军

摘要：从根际土壤分离到一株细菌CY04，通过电镜观察和16S rDNA 序列分析，发现该菌株同已知菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的相似度最高，为99%， 初步认定为枯草芽孢杆菌。抑菌试验结果表明，该菌株对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有一定的抑菌活性，对大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌没有抑菌活性。培养48 h左右是其产生抗菌活性物质的最佳时期。

关键词：根际土壤;枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;鉴定;抑菌活性

中图分类号：Q936         文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）02-0346-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.022

Isolation and Identification of One Strain Producing Antimicrobial Active Substance

YIN Jie，WANG MENG，ZENG Xiao-bo，MA Zhi-yong，CHENG Guo-jun

（College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， China）

Abstract：A bacterium strain， designated as CY04， was isolated from the rhizosphere soil. The strain CY04 had the highest sequence identity with Bacillus subtilis （99%）. Based on morphological characteristics and analysis of the 16S rDNA sequence，  the strain CY04 was identified as Bacillus subtilis. The antagonistic effects showed that CY04 had antimicrobial activity on Staphylococcus aureus， but had little inhibition on Escherichia coli and Bacillus subtilis. The optimal time for the resistant bacteria to produce antimicrobial active substance was 48h after cultivation.

Key words： rhizosphere soil;Bacillus subtilis;identification;antimicrobial activity

随着有害生物耐药性问题的加剧，微生物产生的活性成分物质在人类疾病防治、动物医药保健、植物抗病害及食品防腐等方面表现出巨大的应用潜力。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）通过产生多种抗菌代谢产物，能有效抑制病原菌并促进动植物生长，具有较高的工业、农业以及医药应用价值[1]，同时，枯草芽孢杆菌也被认为是潜在的益生菌[2]。

目前已知枯草芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，包括细菌素、脂肽类抗生素以及酶类、蛋白类抑菌物质等[3]。从枯草芽孢杆菌中分离的Fengycin能够抑制多种重要植物病原真菌的生长[4]。本研究从根际土壤样品中分离到一株能产生抗菌物质的细菌CY04，并根据形态学特征和16S rDNA基因序列对其进行了鉴定，初步认定其为枯草芽孢杆菌，同时对它的拮抗情况及产生原因进行了探讨。

1  材料与方法

1.1  抗菌活性物质产生菌种的筛选

在带有玻璃珠的三角瓶中加入根际土样1 g和99 mL蒸馏水，放置于28 ℃摇床内振荡30 min，取样做梯度稀释后，用其涂布牛肉膏蛋白胨平板，置于37 ℃生化培养箱中培养48 h，从中分离出细菌单株;以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为检测菌，采用纸片法进行菌株筛选，并对产生活性物质进行验证试验。

1.2  CY04细菌的个体形态和电镜观察

在LB平板上观察菌落形态，利用革兰氏染色法在油镜下观察菌体形态。将菌株用戊二醛固定，PBS洗涤和梯度乙醇脱水，真空冷冻干燥机干燥，扫描电镜观察、拍照。电镜放大倍数15 000。

1.3  CY04细菌16S rDNA基因序列测定和系统进化分析

用LB培养基摇床培养菌体至对数期，离心后收集菌体，抽提细菌基因组的总DNA。以CY04菌株基因组DNA为模板扩增16S rDNA基因片段[5]。扩增引物选用细菌通用PCR引物16S-F（5′AAGGAGGTGATCCAGCC3′）、16S-R（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）。扩增程序为，94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30次循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，克隆到pMD18-T载体[宝生物工程 （大连）有限公司]，经酶切和PCR验证后，送北京擎科新业生物技术有限公司测序。序列提交GenBank数据库进行同源性比较分析。采用Bioedit和MAGE 4.0软件以邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树[6]。endprint

1.4  菌株CY04对不同指示菌拮抗能力的测定

以大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌为指示菌，采用牛津杯（内径6 mm，外径8 mm）法测定菌株CY04对不同指示菌拮抗能力[7]。取已活化的指示菌菌液接入牛肉膏蛋白胨液体培养基，37 ℃、20 r/min培养24 h。倒牛肉膏蛋白胨平板，在每个平板的中央置一个已灭菌的牛津杯，吸取指示菌菌悬液在平板上均匀涂布，待平板晾干后进行抑菌试验。将CY04菌株培养液离心，取上清液加入到牛津杯中，37 ℃恒温培养箱中培养48 h，观察生长情况并测量抑菌圈直径。

将活化后的菌株CY04按2%的接种量接入牛肉膏蛋白胨培养液中，每隔6 h取菌液离心，将上清液加入到牛津杯中，测定其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，确定产生活性物质的最佳时期。

1.5  菌株CY04的抗性测定

以抗生素卡那霉素（Km）、氨苄青霉素（Ap）、链霉素（Str）、四环素（Tc）、庆大霉素（Gm）、氯霉素（Cm）、壮观霉素（Spe）为抗生活性物质，测定菌株CY04对抗生活性物质的抗性。将菌株CY04接种到LB培养液中，37 ℃摇床培养过夜。按2%的接种量将菌株接种于含不同浓度抗生素的LB液体培养基中，37 ℃摇床（200 r/min）振荡培养48 h，测定含各种不同浓度抗生活性物质菌液的吸光度，分析菌株CY04生长情况。

2  结果与分析

2.1  菌株CY04筛选及形态观察

进行细菌单株分离、筛选试验发现菌株CY04对金黄色葡萄球菌有较强的拮抗作用。菌株CY04革兰氏染色为阳性，产芽孢，其形态特征见图1。细菌大小为0.3～0.5 μm×1.5～3.0 μm。

2.2  菌株CY04的16S rDNA测序结果

以菌株CY04的DNA为模板进行扩增，获得1.5 kb左右的特异性片段，将测序结果和GenBank已登录的序列进行同源性比对，发现与Bacillus中多个种的序列具有高度同源性;与Bacillus subtilis同源性最高，达到99%。

2.3  菌株CY04的系统进化树

选取同源性较高的菌株，以菌株CY04的16S rDNA序列用MEGA软件的Neighbor-Joining法构建系统进化树（图2）。从系统进化树可以看出菌株CY04与Bacillus subtilis细菌遗传距离最近，相似度达到99%，而与Bacillus licheniformis距离相对较远。依据形态学和同源性比对结果，判断所分离的活性物质产生菌株CY04为Bacillus subtilis。在系统发育地位上属于Bacteria界Firmicutes门 Bacilli纲Bacillales目Bacillaceae科 Bacillus属Bacillus subtilis种。

2.3  菌株CY04的抑菌活性

采用牛津杯法对菌株CY04的抑菌谱试验结果（图3）表明，对革兰氏阴性菌大肠杆菌没有抑制作用，对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌也没有抑制作用，对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用，其抑菌圈达到14.2 mm。说明菌株CY04分泌的活性物质主要针对革兰氏阳性菌的某些类群，具有较强的特异性。菌株CY04对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌没有拮抗作用，可能是因为CY04为芽孢杆菌，其产物不会对同类型菌株产生伤害。

2.4  菌株CY04代谢活性物质产生时期的测定

每隔6 h取样进行抑菌圈测定发现，培养48 h左右培养液产生的抑菌圈最大，进而可以推断菌株CY04在48 h左右产生的活性物质最多，其产生活性物质的时间在其生长稳定后期，这与已有的报道一致[1]。

2.5  菌株CY04的抗性

菌株CY04的抗性的检测结果（表1）表明，除壮观霉素对菌株CY04的最小抑菌浓度达到20 μg/mL外，其他抗生素的最小抑菌浓度均较低，说明菌株CY04对其他抗生活性物质的抗性均较低。一般具有活性物质抗性的细菌在环境中与土著微生物竞争具有一定优势，CY04菌株较低的活性物质抗性，不利于其在环境中生存。CY04菌株自身产生具有拮抗作用的抗生活性物质，是一种有效防卫机制，使其在种间竞争中战胜其他微生物保存自己。

3  小结与讨论

微生物杀菌剂具有高效、无污染、不易产生抗药性等特点，因而有广阔的应用前景。枯草芽孢杆菌产生抗菌活性物质已有相关报道[8-10]。本研究从根际土壤中分离到的细菌菌株CY04根据形态学特征以及16S rDNA序列比较鉴定为枯草芽孢杆菌。菌株CY04对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌没有抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑制作用较明显，说明CY04产生的抗生活性物质具有选择性毒力。进一步研究发现，CY04对除壮观霉素外的其他几种抗生素的抗性均较低，表明CY04菌株产生抗菌物质，是其能够在环境中生存的有效防卫机制。

参考文献

[1] 张  欢，丛丽娜，侯英敏，等.海洋枯草芽孢杆菌HS-A38产直链脂肽活性物质的初步检测[J].海洋科学，2011，35（8）：31-42.

[2] STEIN T. Bacillus subtilis antibiotics： Structures， synthesesand specific functions[J]. Mol Microbiol， 2005，56（4）： 845-857.

[3] 赵新林，赵思峰.枯草芽孢杆菌对植物病害生物防治的作用机理[J].湖北农业科学，2011，50（15）：3025-3027.

[4] 陈  华，袁成凌，蔡克周，等.枯草芽孢杆菌JA产生的脂肽类抗生素-iturinA的纯化及电喷雾质谱鉴定[J].微生物学报，2008，  48（1）：116-120.

[5] SAMBROOK J， FRITSCH EF， MANIATIS T. Molecular Cloning： A Laboratory Manual[M]. 2nd editon. New York： Cold Spring Harbor Laboratory，1989.

[6] KUMAR S， TAMURA K， NEI M. MEGA3： Integrated software formolecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Briefings in Bioinformatics， 2004，5（2）：150-163.

[7] 刘冬梅，李  理，杨晓泉，等.用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J].食品研究与开发，2006，27（3）：110-111.

[8] 刘  静，王  军，姚建铭，等.枯草芽孢杆菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分离纯化[J].微生物学报，2004，44（4）：511-513.

[9] 崔堂兵，刘煜平，郭  勇，等.枯草芽孢杆菌培养生产农用抗真菌素初步研究[J].广东农业科学，2007（1）：51-54.

[10] 李文卓，侯红漫，张公亮.枯草芽孢杆菌CG的抑菌物质的研究[J].食品研究与开发，2013，34（18）：82-85.endprint