大孔吸附树脂纯化山刺玫果总黄酮的工艺研究

2015-03-20杨扬胡雪媛王晓林薛健飞钟方丽

湖北农业科学 2015年2期

杨扬胡雪媛王晓林薛健飞钟方丽

摘要：对山刺玫（Rosa davurica Pall.）果总黄酮的大孔树脂纯化工艺进行了优化研究，以比吸附量和比解吸量为考察指标，进行了D-101大孔树脂纯化工艺的优化。结果表明，其最佳工艺条件为生药浓度0.025 g/mL;最佳上样量为0.23 g/g（生药量/树脂量）;最佳吸附时间为30 min;上柱液pH为2.0～4.0;吸附速率为1 BV/h;洗脱液为3 BV 70%乙醇，洗脱流速为1 BV/h。在此最佳条件下得到的山刺玫果提取物总黄酮含量由20%提高到85%左右。采用D-101型大孔树脂纯化山刺玫果总黄酮的效果较好，且操作简单，为山刺玫果的综合利用提供了依据。

关键词：山刺玫（Rosa davurica Pall.）;果实;D-101型大孔树脂;总黄酮;纯化

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）02-0412-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.039

Purification of Total Flavonoids in Rosa davurica Fruit with Macroporous Adsorption Resin

YANG Yang1，2， HU Xue-yuan1，WANG Xiao-lin1， XUE Jian-fei1， ZHONG Fang-li1

（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering， Jilin Institute of Chemical Technology， Jilin 132022， Jilin，China;2. College of Chemistry， Jilin University ， Changchun 130012，China）

Abstract： The purification of total flavonoids（TS） in Rosa davurica Pall. fruit with macroporous adsorption resin was optimized. The conditions of purification with D-101 macroporous adsorption resin were optimized using absorption ratio and eluation ratio of TS as evaluating indicators. The TS content of the sample， optimum loading quantity of sample（crude drugs weight/D-101 resin weight）， optimum adsorption time， pH value of sample， adsorption rate， ethanol content， desorption rate， the volume of eluant was 0.025 g/mL， 0.23 g/g， 30 min， pH 2 to 4， 1 BV/h， 70% methanol solution and elution volume 3 BV， respectively. Under these conditions the TS purity changed from about 20% to 85%. The purification efficiency of TS with D-101 macroporous adsorption resin was good and easy to operate， which will provide basis for the comprehensive utlization of R. davurica fruit.

Key words： Rosa davurica Pall.; fruit; D-101 macroporous absorption resin; total flavonoids; purification

山刺玫果又名野蔷薇果，系蔷薇科蔷薇属植物山刺玫（Rosa davurica Pall.）的成熟果实，是一种食药同源、经济价值极高的野生果类[1，2]，广泛分布在我国东北、华北、西北等地。山刺玫全身是宝，《中药大辞典》谓其果实有健脾理气、养血调经的作用，且酸甜可食，可治消化不良、食欲不振，民间大量采食或用于泡酒、泡茶等[3，4]，山刺玫果的活性成分主要有三萜类化合物、黄酮、多种维生素、微量元素及人体必需的氨基酸等[5]。山刺玫花大而美丽，为优美的绿化观赏和绿篱树种。山刺玫根有止咳祛痰、抗菌止痢及止血功能。黄酮类化合物具有抗菌、抗炎、保肝、扩冠、消除体内自由基、抗衰老、增强人体免疫力等多种生理活性，还可以降低血液黏度，加快血液循环，临床上用于脑血栓、脑动脉硬化的治疗，具有高效、低毒副作用的优势[6-9]。

大孔吸附树脂是一类具有多孔立体结构的非离子型人工合成的有机高分子聚合物吸附剂，具有化学稳定性高、再生处理简单、选择性好、吸附速率快、吸附容量大、比表面积大、节省费用等诸多优点，被广泛用于天然产物的分离和纯化[10-12]。本试验使用D-101型大孔吸附树脂对山刺玫果总黄酮进行纯化，并优化了D-101型大孔吸附树脂纯化山刺玫果总黄酮的工艺条件，为更有效地利用山刺玫果，发挥其最大经济效益提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料山刺玫果采自吉林市丰满区白山乡，经吉林化工学院药学系薛健飞博士鉴定为蔷薇科蔷薇属植物山刺玫的成熟果实。

1.1.2 试剂芦丁标准品，中国食品药品检定研究院（批号：100800-200707）;D-101型大孔吸附树脂，西安蓝晓科技有限公司;硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、无水乙醇均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂;水为去离子水。

1.1.3 仪器 TU-1810型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司;JY2002型电子天平，上海精密科学仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D型循环水式真空泵，河南省巩义市英峪仪器厂;CS101-AB型电热鼓风干燥箱，中国重庆实验设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制备精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10.0 mg于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.20 mg/mL的芦丁标准品溶液，分别吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL溶液于25 mL容量瓶中，在30 ℃水浴下，加5% NaNO2溶液 1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10% Al（NO3）3溶液 1.0 mL，摇匀，放置6 min，加4% NaOH 10.0 mL，再加60 %乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min。以相应的试剂为空白，按照分光光度法，在505 nm处测定其吸光度A，以吸收度A为纵坐标，芦丁标准品浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线[13，14]，进行直线回归，回归方程：A=11.868C+0.003 5，R=0.999 7，结果表明，芦丁在0.004～0.048 mg/mL范围内呈良好线性关系。

1.2.2 样品溶液的制备取粉碎的山刺玫果25 g，加6倍75%乙醇，85 ℃回流提取3次，每次5 h，过滤，合并滤液，减压浓缩，用去离子水定容至250 mL，备用。

1.2.3 总黄酮含量测定取样品溶液、树脂吸附后液和解吸液各适量，分别置于10 mL容量瓶中，以不加供试品的平行样为空白。按“1.2.1”的方法，于505 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算出样品中总黄酮的含量。

1.2.4 树脂的预处理取D-101树脂加入烧杯中，先以95%乙醇浸泡24 h后湿法上柱，用醇洗至流出液加水不混浊为止，后用去离子水冲洗至无醇味;然后用2 BV 2% NaOH溶液以2 BV/h的流速洗涤1 h，用去离子水洗至中性;再用1 BV 5%HCl溶液以4～6 BV/h的流速洗涤，用去离子水洗至中性，减压抽滤干，放入广口瓶中贴签备用[15]。

2 结果与分析

2.1 D-101型树脂纯化工艺优化

2.1.1 泄漏曲线取处理好的D-101型大孔树脂15 g，湿法装柱，取生药浓度为0.025 g/mL山刺玫果上样液270 mL，缓慢上柱，以3 BV/h流速进行动态吸附，收集流出液，计算总黄酮浓度，泄漏曲线见图1。由图1可知，其泄漏点在第9个点附近，由此确定上样量为0.23 g/g（生药量/树脂量）。

2.1.2 上柱液浓度吸取样品溶液适量，分别稀释2、3、4、5、6倍，将上述样品液加入5根15 g D-101树脂柱上，静止30 min，以3 BV/h的流速进行吸附，收集过柱液，再以70%乙醇60 mL以2 BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，测定溶液中总黄酮浓度（C1为过柱液总黄酮浓度、C2为解吸液总黄酮浓度），计算比吸附量（mg/g）、比解吸量（mg/g），结果见表1 ，计算公式如下：

比吸附量=■

比解吸量=■

从解吸率和比解吸量等综合考虑，将上样浓度确定为原液稀释3倍，即生药浓度0.025 g/mL。

2.1.3 吸附时间取生药浓度为0.025 g/mL山刺玫果上样液140 mL，分别加入4根15 g D-101树脂柱上，以3 BV/h的流速分别吸附15、30、60、90 min，分别收集过柱液，再以70%乙醇各60 mL以2 BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，结果见表2。通过比吸附量的比较，30 min时吸附效果最佳，因此，确定吸附时间为30 min。

2.1.4 吸附流速按“2.1.3”项确定的方法取样上柱后，分别以1、2、3、4、5 BV/h的流速吸附30 min，吸附完全后，分别收集过柱液，按“2.1.3”项确定方法洗脱，试验结果见表3。由比吸附量结果可知，吸附流速可确定为1 BV/h。

2.1.5 上柱液pH 按“2.1.3”项确定方法取样，分别调pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，加入7根15 g D-101树脂柱上，以1 BV/h流速吸附30 min，按“2.1.3”项确定方法洗脱，结果见图2。从图2中可看出，随上样液pH的增大，吸附率逐渐下降，pH在2.0～4.0吸附率比较高，所以将上柱液pH确定为在2.0～4.0。

2.1.6 洗脱溶媒按“2.1.3”项确定方法取样，加于3根15 g D-101树脂柱上，按“2.1.3”项确定方法吸附，再分别用50%、70%、90%乙醇各60 mL以2 BV/h的流速洗脱，结果见表4。通过比解吸量的比较，乙醇体积分数确定为70%。

2.1.7 水洗体积按“2.1.3”项确定方法取样，上柱吸附，然后分别用1、2、3、4、5 BV去离子水洗脱，再按“2.1.6”项确定方法醇洗脱，将各洗脱液减压蒸发，浓缩干燥至恒重后称重，计算干浸膏中总黄酮含量，如表5。根据干浸膏中总黄酮的含量测定结果，确定用3 BV去离子水洗脱。

2.1.8 洗脱流速按“2.1.3”项确定方法取样，上柱吸附，3 BV去离子水洗脱，再分别用70%乙醇各60 mL以1、2、3、4、5 BV/h的流速洗脱，将各解吸液减压蒸发，浓缩干燥至恒重后称重，计算干膏中总黄酮含量，结果见表6。根据干浸膏中总黄酮的含量测定结果，洗脱流速确定为1 BV/h。

2.1.9 洗脱体积按“2.1.3”项确定方法取样，上柱吸附，3 BV去离子水洗脱，再用70%乙醇60 mL以1 BV/h的流速洗脱，按0.5个树脂床体积（即10 mL）收集洗脱液，共收集16个流份，测定收集溶液中总黄酮质量，以洗脱液中总黄酮质量为纵坐标，流份收集编号为横坐标作图（图3）。从图3中可以看出，第6个流份以后溶液中总黄酮量基本不变，故用3 BV（60 mL）70%乙醇即可洗脱完全。

2.2 工艺验证性试验

取已处理好的D-101型吸附树脂3份，各15 g，湿法装柱，分别加入生药浓度为0.025 g/mL的山刺玫果样品液各140 mL，以1 BV/h的流速进行吸附，3 BV去离子水洗脱，然后用60 mL70%乙醇以1 BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，再取样品液、洗脱液减压蒸发，浓缩干燥至恒重后称重，经D-101大孔吸附树脂处理山刺玫果总黄酮样品溶液后，干浸膏中总黄酮含量由20%左右提高到85%左右。

2.3 树脂的重复使用试验

取已处理好的D-101型吸附树脂3份，各15 g，湿法装柱，按“2.2”项确定的方法，取样上柱吸附，水洗，醇洗，收集洗脱液，按“2.2”项下制备干浸膏并测定干浸膏中总黄酮的含量，在试验条件确定后，D-101型大孔吸附树脂重复使用6次后，比吸附量、比解吸量变化均较小，干浸膏中总黄酮含量随重复次数的增加有所降低，在树脂柱使用6次后总黄酮含量由84.60%下降到74.19%。

3 结论

本试验通过对D-101型大孔吸附树脂对山刺玫果总黄酮纯化试验的研究，通过对影响大孔吸附树脂吸附及解吸各种因素的系统研究，筛选出了D-10l型大孔吸附树脂纯化山刺玫果总黄酮的最佳工艺条件为上柱药液浓度为0.025 g/mL，药液pH为2.0～4.0，吸附时间30 min，吸附速率为1 BV/h，吸附后用3 BV去离子水洗脱，再用3 BV 的70%乙醇以1 BV/h的流速洗脱，纯化后山刺玫果干浸膏中总黄酮含量由原来的20%提高到85%左右，树脂可以重复使用6次，表明D-101型大孔树脂对山刺玫果总黄酮具有较好的纯化性能，D-101大孔吸附树脂纯化山刺玫果总黄酮的工艺不仅具有比吸附量、比解吸量高等特点，而且具有洗脱率较高、树脂再生简便等优点，在含有山刺玫果总黄酮的产品分析和生产中具有一定的推广应用价值，为山刺玫果总黄酮在食品、药品领域的综合应用提供了依据。

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