武陵山羊肚菌液体培养条件优化研究

刘达玉 王慧超 郑林用 戴玄 李宗堂 陈今朝

摘要：对武陵山羊肚菌（Morchella  esculenta）的液体培养条件、培养基进行了优化。结果表明，最适液体培养条件为pH 6.0、培养液装量100 mL/250 mL、接种量8%、温度25 ℃、摇床转速180 r/min、培养时间6 d;最适发酵培养基为4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4和0.10% MgSO4·7H2O。在此条件下，菌丝体干重为6.880 g/L，胞外多糖产量为0.861 g/L。

关键词：武陵山羊肚菌（Morchella  esculenta）;液体培养;菌丝体;胞外多糖

中图分类号：Q949.32        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）02-0405-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.037

Optimizing of Liquid Culture of Morchella esculenta in Wuling Mountain

LIU Da-yu1，WANG Hui-chao2，ZHENG Lin-yong3，DAI Xuan2，LI Zong-tang4，CHEN Jin-zhao2

（1.Faculty of Biotechnology Industry，Chengdu University， Chengdu 610106， China;2.Life Science and Technology Institute， Yangtze Normal University， Chongqing 408100，China; 3.Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066，China;

4.Chengdu Rongzhen Edible Fungi Ltd.， Chengdu 611733，China）

Abstract： The conditions and media of liqiud culture of Morchella esculenta in Wuling Mountain were optimized. The results showed that the optimal conditions were the pH value of 6.0， the medium capacity of 100 ml/250 ml triangle bottle， the inoculation quantity of 8.0%， the temperature of 25 ℃， the rotation speed of shaking flask of 180 r/min and the time of 6 days. The optimal liquid fermentation media of Morchella esculenta were 4.0% sucrose，0.70% yeast powder，0.15% KH2PO4 and 0.10% MgSO4·7H2O. Under these conditions， the dry weight of the mycelia and the yield of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta were up to 6.880 g/L and 0.861 g/L， respectively.

Key words： Morchella esculenta in Wuling Mountain; liquid culture; mycelium; extracellular polysaccharide

羊肚菌（Morchella esculenta）是一种营养丰富、美味可口的珍贵食药用菌，其性平、味甘，益肠胃、化痰理气，补肾、壮阳，补脑、提神，具有增强肌体免疫力、抗疲劳、抗衰老、降血脂、抗病毒和抑制肿瘤等功能[1，2]。虽然国内外已有一些羊肚菌人工栽培的报道，但由于其对气候、土壤等环境条件要求苛刻，至今仍未实现规模化栽培[3-6]。自然资源很少，远不能满足市场需求。为此，笔者分离重庆武陵山羊肚菌，并对其液体培养条件进行了优化，拟为其人工栽培、食品和药品开发提供依据。

1  材料与方法

1.1  材料

菌种：武陵山羊肚菌，长江师范学院生物技术实验室分离保存。

母种PDA培养基：20%马铃薯（去皮）煮汁，2.0%葡萄糖，0.30%蛋白胨，1.8%琼脂，0.10% K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，pH自然[7]。

液体种子培养基：10%马铃薯煮汁，2.0%葡萄糖，0.50%蛋白胨，0.10%K2HPO4，0.05%MgSO4，pH 6.0[8]。

发酵培养基：4.0%葡萄糖，0.50%蛋白胨，0.10%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，pH 6.0。

1.2  方法

1.2.1  菌种活化  把保藏的羊肚菌母种转接到无菌PDA培养基平皿上，25 ℃培养7 d，备用。

1.2.2  液体培养方法  将种子培养液装入250 mL锥形瓶中，每瓶100 mL，0.10 MPa、121.3 ℃灭菌20 min，冷却，接羊肚菌母种于锥形瓶中，160 r/min、25 ℃培养3 d备用[9]。发酵培养液装量同种子培养液，培养条件相同，培养时间6 d。

1.2.3  发酵培养基选择  选取蔗糖、酵母粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O 4个因素，设计L9（34）正交试验，因素与水平见表1。通过试验，筛选最佳培养基配方。

1.2.4  菌丝体干重测定  取发酵液30 mL，在4 000 r/min离心10 min，沉淀菌丝体用去离子水洗涤3次，于70 ℃下烘干至恒重，称重，每个处理重复3次。

1.2.5  羊肚菌胞外多糖测定  参照武秋立等[10]的方法，取出菌丝体羊肚菌发酵液加入3倍乙醇于0 ℃下沉淀12 h，于4 000 r/min离心10 min;弃上清液，沉淀加少量乙醇再离心，重复两次后，将沉淀用去离子水溶解定容，用硫酸-蒽酮法于620 nm处测吸光度，根据硫酸-蒽酮葡萄糖标准曲线计算胞外多糖产量。

1.2.6  数据处理  试验数据用DPS 7.05版软件处理，用LSD法比较菌丝体干重和多糖的差异显著性。

2  结果与分析

2.1  液体培养条件选择

2.1.1  pH对菌丝体干重和多糖产量的影响  用2.0 mol/L HCl或氢氧化钠溶液调节培养液pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，接种培养（表2）。当pH 6.0时，菌丝体生长最快，其干重和胞外多糖产量均最高; pH 6.0与pH 7.0菌丝体干重之间差异不显著，而pH 6.0与pH 5.0胞外多糖产量之间差异极显著;当pH 4.0时，菌丝体干重及多糖产量均最低。可见，菌丝体生长、多糖形成的最适pH为6.0。

2.1.2  培养液装量对菌丝体干重和多糖产量的影响  250 mL三角瓶分别装60、80、100、120、140 mL培养液（表3）。当培养液装量为100 mL时，菌丝体干重、多糖产量均最高;当装量为140 mL时菌丝体干重、多糖产量均最低。因此，最适装量为100 mL。

2.1.3  接种量对菌丝体干重和多糖产量的影响  培养液接种量分别为4%、8%、12%、16%、20%（表4）。当接种量8%时，菌丝体干重、多糖产量均最高;接种量8%与12%菌丝体干重、多糖产量之间均差异极显著;接种量20%时，菌丝体干重、多糖产量均最低。可见，最适接种量是8%。

2.1.4  温度对菌丝体干重和多糖产量的影响  培养温度分别为21、23、25、27、29 ℃（表5）。在25 ℃时，菌丝体干重、多糖产量均最高;在21℃时，菌丝体干重、多糖产量均最低。可见，最适培养温度是25 ℃。

2.1.5  转速对菌丝体干重和多糖产量的影响  将培养液置于摇床上振荡培养，转速分别设置为140、160、180、200、220 r/min（表6）。当转速为180 r/min时，菌丝体干重最重，180、200 r/min菌丝体干重之间差异显著;当转速为200 r/min时，多糖产量最高;而200、180 r/min多糖产量之间差异不显著。因此，最适转速为180 r/min。

2.1.6  培养时间对菌丝体干重和多糖产量的影响  培养液分别培养4、5、6、7、8 d（表7）。当培养6 d时菌丝体干重最重，培养6 d与7 d菌丝体干重之间差异极显著;培养8 d时多糖产量最高，培养8 d与7 d多糖产量之间差异不显著，而培养7 d与6 d多糖产量之间有极显著差异。因此，最适培养时间为6 d。

2.2  发酵培养基选择

2.2.1  碳源对菌丝体干重和多糖产量的影响  分别用4.0%可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇和麦芽糖代替发酵培养基中的葡萄糖为碳源（表8）。结果菌丝体干重在蔗糖培养基中最重，在可溶性淀粉培养基中最轻;多糖产量在可溶性淀粉培养基中最高，在麦芽糖培养基中最低。综合菌丝体干重和多糖产量，选蔗糖为最适碳源。

2.2.2  氮源对菌丝体干重和多糖产量的影响  分别用0.50%牛肉膏、酵母粉、硫酸铵和尿素代替发酵培养基中的蛋白胨（表9）。菌丝体干重、多糖产量在酵母粉培养基中均最高，二者在尿素培养基中均最低。因此，酵母粉是最适氮源。

2.2.3  无机盐对菌丝体干重和多糖产量的影响  分别用0.10% K2HPO4、CaSO4·0.5H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O代替发酵培养基中的K2HPO4和MgSO4·7H2O（表10）。在只有K2HPO4培养基中菌丝体干重、多糖产量均最高，但在K2HPO4与MgSO4·7H2O培养基中菌丝体干重、多糖产量之间差异不显著;在ZnSO4·7H2O培养基中菌丝体干重、多糖产量均最低。因此，最适无机盐是K2HPO4。

2.2.4  正交试验结果  由表11可知，以菌丝体为指标的培养基最优配方为A2B3C3D2;以多糖为指标的培养基最优配方为A2C3D3B2;两者结合并合并主次顺序选A2B3C3D2，即4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4、0.10% MgSO4·7H2O。但该培养基配方不在正交试验列表中，用该培养基配方进行验证试验，结果菌丝体干重为6.880 g/L，胞外多糖为0.861 g/L。

3  小结

武陵山羊肚菌的最适液体培养条件为pH 6.0、250 mL锥形瓶培养液装量为100 mL、接种量8%、温度25 ℃、摇床转速180 r/min，培养时间6 d。最适液体发酵培养基为4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4、0.10% MgSO4·7H2O。在此优化条件下，菌丝体干重为6.880 g/L，多糖产量为0.861 g/L，菌丝体干重、胞外多糖产量分别比正交试验表中的最优配方A2B3C1D2高9.71%和19.09%。

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