pH梯度法制备维生素C脂质体

刘力铭，顼兴敏

（青岛科技大学化工学院，山东青岛 266042）

pH梯度法制备维生素C脂质体

刘力铭，顼兴敏

（青岛科技大学化工学院，山东青岛 266042）

制备维生素C脂质体，并考察其包封率的影响因素。采用pH梯度法制备维生素C脂质体，以紫外分光光度法和粒度仪分别测定脂质体的包封率和粒径，并考察外水相pH、超声时间、载药温度及药脂比对包封率的影响。结果显示包封率随外水相pH的降低而增加，最佳超声时间为15 min，随着载药温度的增加包封率有提高的趋势，最佳药脂比为1∶5。该条件下pH梯度法制备的维生素C脂质体的包封率为（49.79±1.6）%（n=3），平均粒径为（118.3±9.6）nm。

维生素C；脂质体；pH梯度法；包封率

脂质体（liposome）是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000 nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。生物学定义：当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，称为脂质体。药剂学定义：系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。

维生素C（Vitamin C），又名抗坏血酸，广泛应用于化妆品和保健品中，具有良好的美白祛斑、延缓衰老的美容功效，近年来更发现其具有良好的抗癌性能。维生素C作为水溶性维生素，在人体内不能储存，必须每天补充。其水溶液极不稳定且不易透过皮肤，所以维生素C的使用受到极大的限制[1]。将维生素C做成脂质体溶液，不仅可以极大的提高稳定性，且能使之更容易的透过皮肤，应用前景广阔[2]。

本实验选用大豆卵磷脂和胆固醇作为膜材，采用pH梯度法制备维生素C脂质体。主要目的是以平均粒径和包封率为指标，优化制备脂质体的工艺和处方，从而制备包封率高、粒径均一、稳定性好的维生素C脂质体。

1 仪器与试剂

UV1000紫外分光光度计（北京莱伯泰科有限公司）；IT-09A5型恒温磁力搅拌器（上海一恒科学仪器有限公司）；Zetasizer Nano ZS90纳米粒度和Zeta电位及分子量分析仪（英国马尔文仪器有限公司）；KH-250DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；YP-202N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

维生素C（天津鑫鑫制药厂，含量99%）；大豆卵磷脂（化学纯，天津市博迪化工股份有限公司）；胆固醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；维生素E（郑州荔诺生物科技有限公司，含量98%）；氯仿（分析纯，烟台三和化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，天津市博迪化工股份有限公司）；磷酸二氢钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 脂质体的制备

精密称取处方量大豆卵磷脂、胆固醇和维生素E放置于烧杯中，加入适量氯仿，将烧杯放置于恒温磁力搅拌器上，常温下搅拌至完全溶解。将溶液转移至圆底烧瓶中，加入磷酸盐缓冲液，超声得乳白色溶液。将乳白色溶液在旋转蒸发仪上减压蒸发，直至氯仿完全挥发，烧瓶内壁出现透明薄膜。烧瓶中加入含有维生素C的磷酸盐缓冲液（含有焦亚硫酸钠和依地酸二钠）使膜充分水化，孵育一定时间后生成乳白色半透明溶液。所得半透明溶液分别过0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜各3次，即得维生素C脂质体[3]。

2.2 标准曲线绘制

精密称取5.1 mg维生素C置于100 mL容量瓶中，加入pH 5.0的硫酸溶液，振摇、溶解、定容。分别移取1、1.5、2、3、3.5、4和5 mL于25 mL容量瓶中，加硫酸溶液定容、摇匀，在266 nm处测吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归即得标准曲线方程：y=0.1129x-0.0861，R2=0.9995。结果表明维生素C在2.04～10.20 μg/ mL内线性关系良好[4]。

2.3 回收率实验

分别取处方量维生素C药物的80%、100%、120%，分别加入适量空白脂质体溶液。摇匀后，用甲醇破膜，用pH 5.0的硫酸溶液定容。测定维生素C的紫外吸收，计算得回收率分别为（99.3± 1.9）%、（101.6±2.8）%、（103.5±3.6）%（n=3）。结果表明，制备脂质体的辅料对样品测定没有影响，且方法简便、重现性好[5]。

2.4 包封率测定

取一定量维生素C脂质体溶液置于高速离心机中。在转速为12000 r/min下，每次离心5 min，共3次，离心后，分别取上清液和被甲醇破乳的沉淀物进行紫外测定计算出药物含量，其中上清液中是未包封的药物，沉淀物中是被包封的药物，根据公式：包封率=包封药物量/（包封药物量+未包封药物量）×100%，计算得出包封率。

2.5 正交试验设计

以药脂比（A）、超声时间（B）、外水相pH（C）和载药温度（D）为考察因素，根据单因素实验的结果选取恰当的水平，用L9（34）正交试验法优化工艺处方，结果见表1和表2。

表1 正交试验因素及水平

表2 正交实验结果

通过对正交实验进行极差分析可知，各因素对包封率影响的顺序为B＞C＞D＞A。分析得出最优化组合为A1B3C3D3。

2.6 验证实验

以筛选出的最优化条件制备脂质体，重复3次，得到脂质体的平均包封率为（49.79±1.6）%，平均粒径为（118.3±9.6）nm，平均Zeta电位为（-39.9±2.1）mV。纳米粒度分布图、Zeta电位分布图如下：

图1 纳米粒度分布图

图2 Zeta电位分布图

3 讨论

膜材中加入少量维生素E可有效地抑制磷脂的氧化速度，提高脂质体的稳定性。

维生素C在空气中极易被氧化，因此处方中需要加入焦亚硫酸钠和依地酸二钠来增加维生素C脂质体的稳定性[7]。

制备的维生素C脂质体的平均Zeta电位为（-40.8±2.3）mV，而平均Zeta电位在-30～60 mV之间的脂质体溶液是很稳定的，不易泄漏[3]。

本文制备的脂质体包封率达到（49.79±1.6）%，且粒径分布均匀、形态规整、稳定性好。本方法处方工艺简单、条件温和、重现性好，可扩大生产，有望进一步制备成维生素C脂质体注射液。

[1]刘沐生.分光光度法测定柚子中的维生素C[J].光谱实验室，2012，29（5）：2897-2900.

[2]DESAI M P,LABHASETWAR V,AMIDON G L,et al.Gastrointestinal uptake of biodegradable microparticles:Effect of particle size[J].Pharmaceutical Research,1996,13（12）:1838-1845.

[3]牟琳琳，徐洋，蒋宫平，等.改良pH梯度法制备盐酸小檗碱脂质体[J].中国药学杂志，2013，48（1）：49-53.

[4]刘伟新，周爱德.紫外分光光度法对几种新疆产黑加仑中维生素C含量的测定[J].新疆中医药，2007，25（4）：12-14.

[5]杜昌余.纳米粒制备方法的筛选及工艺处方优化[D].青岛：青岛科技大学，2013.

[6]陈召红，刘皈阳，魏亚超.脂质体包封率测定方法研究进展[J].解放军药学学报，2011，27（1）：79-82.

[7]刘亚文，曹光群，陈婷婷.维生素C脂质体的制备研究[J].大豆科学，2007，26（2）：270-272.

（责任编辑：朱小惠）

Preparation of vitamin C liposomes by the pH gradient method

LIU Liming,XU Xingmin
（Chemical Engineering College,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China）

Vitamin C liposomes were prepared by the pH gradient method.The entrapment efficiency and the size of vitamin C liposomes were detected by UV-visible spectrophotometry and particle analyzer,respectively.Effects of various factors on the entrapment efficiency including exterior pH,ultrasonic time,incubation temperature and the ratio of drug to lipid,were investigated. The results showed that the entrapment efficiency increased with the decrease of pH and increase of incubation temperature.,The optimal ultrasonic time and ratio of drug to drug was 15 min and 1∶5.The entrapment efficiency of vitamin C liposomes under the optimized conditions was 49.8% and the mean diameter was 118.3 nm.

vitamin C;liposome;pH gradient method;entrapment efficiency

TQ469

A

1674-2214（2015）02-0017-03

2014-11-11

刘力铭（1988—），男，辽宁丹东人，硕士，研究方向为药物新剂型，E-mail：403005919@qq.com.