稻瘟菌毒素胁迫下水稻根部生理变化及相关基因表达研究

张 君，罗雅丽，童 涛，叶陆青，许 巧，陆文怡，姜 华，薛大伟

（1.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州310036；2.浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江 杭州310021）

水稻是重要的禾谷类粮食作物，全世界有近1／2的人口依赖水稻作为主要的卡路里来源［1］.因此水稻产量的稳定具有重要的社会价值和战略意义［2］.稻瘟病是水稻上的一种毁灭性病害［3］，世界上栽培水稻的地区均有发生，每年给水稻造成11%～30%的产量损失［4-5］.

目前为止，已鉴定了80多个稻瘟病抗性基因［6］，其中有40个被定位［7］，有22个通过图位克隆等方法被成功克隆，但由于稻瘟病菌群体多变、水稻品种抗性易丧失等诸多因素［8］，水稻抗性品种在长期生产上仍面临着巨大障碍.稻瘟病的病原菌为子囊菌（Magnaporthegrisea（Hebert）Barr），除了从叶、茎等地表部位侵入水稻外，稻瘟病菌还能从根部侵入水稻植株，引发同样的症状［9］.但目前对稻瘟菌侵染及影响水稻根部的生理生化及分子机理研究较少.本研究利用稻瘟病菌粗毒素处理丽江新团黑谷和谷梅二号的幼苗根部，对其生理生化和病害防卫相关基因进行定量分析研究，为进一步了解稻瘟菌对水稻根部的感染机制及相关分子机理提供参考.

1 材料与方法

1.1 供试品种及水稻幼苗培养

本实验以稻瘟病敏感品种丽江新团黑谷和抗性品种谷梅二号为研究对象.水稻种子经过浸种、催芽后，挑选96粒发芽良好种子，播种在剪掉管底的96孔板中，放入光照培养箱水培，培养液采用国际水稻所（IRRI）推荐的水培营养液配方.水稻苗在两叶一心时期备用.

1.2 水稻苗期稻瘟菌粗毒素处理

实验用稻瘟病接种菌株为Guy11.挑取稻瘟病菌Guy11菌丝于山口富夫培养液，25 ℃避光振荡（150 r／min）培养7～12d后，将培养液用无菌纱布过滤，离心取上清液并高压湿热灭菌，得到粗毒素原液［10-12］.将原液稀释成1／4的粗毒素处理液，在恒温培养箱中分别处理丽江新团黑谷和谷梅二号活体水稻苗根部0、6、12、24、48h.分别取地上部和地下部，放入-80℃备用［11，13］.

1.3 水稻生理生化指标测定

称取0.3g水稻叶鲜样加8mL 0.05mol／L（pH 7.8）的PBS于冰浴中研磨，研磨样品放入15mL离心管，4℃下10 000r／min离心20min，取上清液用于过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量测定，所有测定重复3次.MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸分光光度法；SOD 活性测定采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法；POD 活性测定采用愈创木酚氧化法；CAT 活性测定采用紫外吸收法.用SHIMADZU UV-2410PC分光光度计酶动力学软件测定吸光度的变化.

1.4 水稻RNA提取与荧光定量分析

RNA 提取采用Invitrogen公司的Trizon试剂.总RNA 在经过Invitrogen公司DNA 酶消化试剂盒处理后进行反转录.cDNA 第一链反转录利用Takara公司的AMV 反转录酶进行，具体实验步骤参考厂家说明.反转录完成后，将cDNA 保存于-80 ℃备用.荧光定量实验在ABI公司7500型Real-time PCR仪中进行.采用2-ΔΔCT方法计算基因相对表达量［14］.

2 结 果

2.1 稻瘟菌毒素处理不同时间的生理生化表现

为了解不同时间内稻瘟菌毒素侵染水稻根部后，水稻各项生理指标的变化情况，本研究分别对丽江新团黑谷和谷梅二号两个水稻品种进行了不同时间的处理.结果表明：在不同取样时间，各处理水稻根部的SOD 活性都表现出了不同程度的升高（图1A），且丽江新团黑谷的SOD 活性总体要高于谷梅二号.在两个品种中，POD 活性在毒素处理不同时间后表现出显著的差异，除丽江新团黑谷叶部POD 活性在处理后相对对照组普遍下降外，其他处理都有所增大（图1B）.

图1 稻瘟菌毒素处理下不同生理指标分析Fig.1 Analysis of physiological indices of rice under blast fungus toxin stress

CAT 的活性在处理不同时间后的变化如图1C 所示，丽江新团黑谷叶部CAT 活性随着时间的延长先下降后升高，而谷梅二号叶部CAT 活性随着时间的延长则普遍显著增加.另外，两品种根部的CAT 活性都表现为随着时间的延长先降低后增加，且两品种叶部的CAT 活性明显高于根部.植物体内过剩活性氧自由基可引发膜脂过氧化作用，MDA 是膜脂过氧化的主要产物之一，其积累是活性氧毒害作用的表现，因而可以作为植物膜脂发生过氧化反应的强弱指标［15］.在本研究中，随着取样时间的延长，MDA 在两个水稻品种中都发生了显著积累，且两品种根部的MDA 含量都随着时间的延长而增加.比较两品种MDA 含量的变化，两者根部的变化相差不大，而其叶部含量相差较大（图1D）.

2.2 水稻病害防卫相关基因的表现

植物对病害的防卫反应主要依赖水杨酸和茉莉酸／乙烯介导的分子信号传导途径［16-17］.为了解丽江新团黑谷和谷梅二号两个水稻品种的抗性相关基因在不同处理时间下的表现，本研究共对8个病害防卫相关基因（表1）进行了荧光定量PCR 分析，结果如图2所示.

表1 Real time-PCR 引物序列Tab.1 Prime sequences used in real time-PCR

图2 稻瘟菌毒素处理下幼苗叶和根中相关基因的相对表达量Fig.2 The relative expression of genes in the rice seedling under blast fungus toxin stress

PR1b是病程相关蛋白基因，在植物中主要抑制病原菌的生长、繁殖和传播.毒素处理后，PR1b基因在谷梅二号中的相对表达量明显高于稻瘟病敏感品种丽江新团黑谷，在24和48h的表达量分别达到最大，这可能是毒素处理时间的增加诱导PR1b基因表达量大增所致.PR4基因的表达在丽江新团黑谷和谷梅二号中与PR1b类似.PR1a却不同，虽然随着处理时间的增加，表达量在两品种中均总体上升，但在48 h时，PR1a在丽江新团黑谷根中的表达量高于谷梅二号.而另一个病程相关蛋白基因JIOsPR10在敏感品种丽江新团黑谷中的表达量先上升后下降，在48h时降到最低，在根和叶中检测不到；而在谷梅二号的叶中，48h时表达量达到最大，根中的表达量则随着处理时间的增加基本无变化（图2）.

与水杨酸合成相关的苯丙氨酸裂解酶基因PAL在稻瘟病抗性品种谷梅二号幼苗根和叶中的表达水平均显著增高，48h时其在根中的表达量是未处理时的8倍.PAL在敏感品种丽江新团黑谷根和叶中的表达量呈波浪状，表达不稳定.β-1，3-葡聚糖酶类似基因Gns1的表达量在两个品种中随着处理时间的延长，均呈上升趋势，且在丽江新团黑谷叶中的表达量高于抗性品种谷梅二号.几丁质酶基因Cht-1的表达量在毒素处理后期均升高，48h时，两品种叶中的表达量差异不大，但谷梅二号根中的表达量高于丽江新团黑谷.查尔酮合成酶基因CHS的表达量与Gns1类似，随着处理时间的延长，在两个品种中均呈上升趋势且差异不大（图2）.

3 讨 论

稻瘟病是影响水稻生产的主要病害，本研究以稻瘟菌毒素侵染水稻幼苗根部，通过生理分析及相关基因的荧光定量分析来研究稻瘟菌感染水稻根部的分子机理，以期为深入了解水稻病害的根部感染机制奠定一定的基础.

植物不能像动物一样移动，因此面对逆境需要消耗大量能量主动应对.这种植物对逆境的主动应对在分子层面表现为复杂的胁迫应答及调控机制［6］.此外，这些精巧的调控机制将最终调动相关生理指标的变化.在本研究中，不同处理生理指标的变化并不完全相同.就SOD 来说，在不同处理间的变化非常微妙，没有显著性的改变.而其它3个生理指标变化都非常剧烈，且呈现一定处理相关性，具有基因型差异.

前人的研究表明，植物对病害和机械损伤的防御主要通过SA 和JA／乙烯信号传导途径介导［18］.本研究所选取的8个抗性相关基因中，PR1a、PAL、Cht-1和PR4主要涉及水杨酸通路，JIOsPR10则主要与茉莉酸通路相关，PR1b与水杨酸和茉莉酸都相关［19］，CHS和Gns1则可能与茉莉酸通路有关.研究结果显示，稻瘟菌毒素处理水稻幼苗根部后，防卫信号传导途径被激活.稻瘟病抗性水稻的防卫相关基因的转录水平在处理后期明显高于敏感水稻，最显著的标志是水杨酸途径中的关键基因PAL在48h时根中的表达量是丽江新团黑谷的8倍.同样，处理后期时病程相关蛋白JIOsPR10、PR1b和PR4在抗性水稻中的表达量也远高于敏感水稻，其中PR1b和PR4是在根中，而JIOsPR10是在叶中.

植物防御反应的调控非常复杂，SA 和JA／乙烯介导的防卫途径之间的分工尚不明确.植物在其整个生活史中既要应对昆虫的取食危害，又要抵御病原菌的侵染.因此植物在长期的进化过程中，体内同时保留了依赖SA 介导和依赖JA 介导的信号传导途径，并通过调节SA 和JAs的含量来准确调控这两个途径［20］.本研究中，稻瘟菌毒素处理后，这两个途径中的相关基因或关键基因与本底水平相比都表现出上调或下调的趋势，说明两个途径都得到了表达.植物的防卫基因还包括几丁质酶基因、β-1，3-葡聚糖酶基因及病程相关蛋白基因等［21］.本研究针对水稻的主要防卫途径——SA 和JA／乙烯信号传导途径中的8个相关基因如苯丙氨酸解氨酶基因、几丁质酶基因以及病程相关蛋白等基因进行了转录水平上的定量分析，为水稻根部稻瘟病毒素诱导的抗性机制研究奠定了基础.

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