卵源性多价抗蝮蛇毒IgY的制备及检测

单琳琳，陈传稀，蔡梦思，黄利锋，何 莹，高建芳

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州310036）

蝮亚科毒蛇是中国分布广、资源保有量较多的类群，经常会有人被蝮蛇咬伤，这些种类涉及亚洲蝮属、竹叶青蛇属、原矛头蝮属和烙铁头属等广义蝮蛇.每当水患过后，各类蝮蛇所致蛇伤病例会明显增加，以致各地抗蛇毒血清储备告急，进而延误了部分患者治疗，如2010—2012年的长江中下游省份水患就造成了重大影响.就全国蝮蛇类致伤病例而言，主要由竹叶青（Trimeresurusstejnegeri）、中介蝮（Gloydiusintermedius）、高原蝮（Gloydiusstrauchii）、短尾蝮（Gloydiusbrevicaudus）、乌苏里蝮（Gloydiusussuriensis）、岩栖蝮（Gloydiussaxatilis）、菜花原矛头蝮（Protobothropsjerdonii）和原矛头蝮（Protobothropsmucrosquamatus）等种类所致，其中后5种所致蛇伤的影响范围较广，基本覆盖除西北部省份以外的中国其它省份.

当前国内临床使用的抗蝮蛇毒血清是以短尾蝮蛇毒为抗原免疫马匹所制备的［1-2］，此类抗体的单价较贵，蛇伤治疗成本相对较高.据覃公平抽样调查的结果，国内每年预计有近5万人次需要注射抗血清［3］.然而，目前临床上使用的抗蛇毒马血清存在许多不足：制备周期长、抗体纯化的要求高、流通不方便、价格昂贵、可能带来副作用等，使其生产与需求之间的矛盾一直不可缓解，从而影响了抗蛇毒血清在临床上的广泛应用［4-5］.因此，在不断完善和总结抗蛇毒血清制备技术的同时，新的蛇伤治疗药物的开发和研究有着极其重要的意义.

目前，在医用抗体领域，鸡源性抗体制备技术因其较传统抗体制备技术具有诸多优点而被广泛采用，如母鸡饲养简单、鸡卵收集方便，无需抽取血液、无损伤，产率高、成本低、稳定性好、特异性强、过敏性小等［6-11］.本研究选用莱航鸡为载体，用蛇毒类毒素免疫并收集鸡卵，旨在研究一种新型鸡源性多价抗蝮蛇毒卵黄抗体，以求对上述广义蝮蛇中的5种（短尾蝮、乌苏里蝮、岩栖蝮、菜花原矛头蝮和原矛头蝮）蛇毒均有解毒效果，从而弥补单价马源性抗蛇毒血清的不足，为蛇伤患者提供新的治疗药物.

1 材料与方法

1.1 实验用蛇毒及动物

实验用短尾蝮、乌苏里蝮、岩栖蝮、原矛头蝮和菜花原矛头蝮蛇毒为实验室自储品.实验用莱航母鸡（20～22周龄）2只购自农贸市场，母鸡运回实验室后用发酵床法单笼饲养于25 ℃恒温室，控制室内相对湿度为60%，光照时间16h，饲养期间提供足量的饮水和食物，在食物中添加适量钙质和维生素.每天检查莱航母鸡是否具有鸡冠鲜红、羽毛整齐光亮、两眼明亮、精神活泼、当人靠近时表现比较兴奋、有求食欲以及能对外界刺激迅速作出反应等特点，以便随时判断实验期间动物的生理状态.

1.2 抗原制备及母鸡免疫

动物免疫主要参照刘四红等［12］和王桂平等［13］的方法，并进行适当调整.将实验用5种蛇毒从-80 ℃超低温冰箱取出后，恢复至室温，随后称取实验所需剂量，溶于生理盐水，控制溶液最终质量浓度为10 mg／mL.各种蛇毒溶液等体积混合后，置于60 ℃恒温水浴中孵育30min减毒制备类毒素.随后离心取上清，并保存于-20 ℃冰箱备用.待莱航鸡适应环境后，将上述类毒素与弗氏完全佐剂（Sigma-Aldrich）混合乳化，以0.2mg／只的剂量经鸡双翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位点注射进行初次免疫.在初次免疫后第11、21和31天进行首程、第二次和第三次加强免疫，注射用类毒素改由弗氏不完全佐剂（Sigma-Aldrich）乳化，3次免疫剂量分别为0.4、0.8和0.8mg／只.初次免疫前5天开始收集鸡卵，直至免疫后90天结束，所有鸡卵经编号并判别是否正常后保存于4 ℃冰箱备用.

1.3 卵黄IgY抽提与浓度测定

合并单只鸡每5d内的全部鸡卵，用水洗净，并经75%酒精消毒后，敲开蛋壳，用卵黄分离器尽量去除蛋白，之后将卵黄转至滤纸上轻轻滚动，尽量吸干残余蛋清，用针刺破卵膜，收集卵黄液.通过冻融法、水稀释法和PEG 法抽提IgY，用硫酸铵法获得IgY 沉淀；随后，将IgY 沉淀溶于0.01mol／L pH 7.4PBS后，用0.01mol／L pH 7.4的PBS缓冲液透析8h脱盐，每隔2h更换缓冲液，收集脱盐后溶液并冷冻干燥，保存于-20℃冰箱备用［14-17］.浓度测定时，取适量冻干粉溶于无菌水配制成抗体原液，用Bradford法测定卵黄抗体稀释液浓度［18］，每个样品重复测定3次.

1.4 ELISA 检测

卵黄抗体IgY 与蛇毒ELISA 检测方法参照Gao等［19］.将质量浓度为2μg／mL的5种蛇毒分别包被96孔酶标板，每孔100μL，用不含蛇毒的包被液作为对照，4 ℃包被过夜，每一反应均设置3个检测孔.用PBST 漂洗液洗去未结合蛇毒，随后各孔用2%脱脂奶粉在37 ℃封闭1h.PBST 漂洗液洗涤后，每孔加入每种抽提法所得的各个批次的IgY 溶液，37 ℃温育1h.洗去未结合IgY 后，各孔加入经PBST 溶液稀释的驴抗鸡IgY／IgG 二抗（上海生工，稀释比1∶10 000），37℃温育1h.用PBST 漂洗液洗去未结合的酶标二抗后，各孔加入100μL底物液（含0.5mg／mL OPD 和0.006% H2O2的0.15mol／L柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0），反应20min后加入50μL 2.5mol／L的硫酸终止显色.随后，用SpectraMax 384酶标仪在490 nm 下读取并记录各孔的吸光值.计算所有OD 值的平均值及SD值，随后用Sigmaplot 11.0软件制作5种蛇毒与IgY 抗体免疫中和反应的变化过程，并用Log Normal四参曲线公式拟合相应的变化趋势.

1.5 SDS-PAGE和western blot检测

蛇毒蛋白SDS-PAGE以及与卵黄抗体IgY 间的western blot检测方法参照Gao等［19］.根据ELISA的检测结果，选择效价较高，且相对比较集中的第七、九和十一共3个批次的抗体冻干粉等量混合，用无菌水稀释成100μg／μL溶液后用于western blot检测.5种蛇毒蛋白用12%分离胶在Mini Protean III sys-tem（Bio-Rad）电泳系统中进行SDS-PAGE 分离.电泳结束后，胶上蛋白经半干转印至PVDF 膜（0.45 μm）上，随后用含2%脱脂奶粉的PBST 溶液在4 ℃中封闭过夜.封闭结束后，PVDF膜经PBST 漂洗，与适量体积的上述IgY 抗体溶液（1∶1 000稀释）在37 ℃恒温培养箱中温育1h.温育结束后，用PBST 漂洗去除未结合的抗体，随后加入HRP标记的驴抗鸡IgY／IgG 二抗（1∶5 000稀释），在37 ℃下温育1h.用PBST 洗去未结合的二抗后，将膜浸入DAB显色液显色直至条带清晰可见，然后用蒸馏水终止显色.显色结果经Umax2100扫描仪扫描，并用Tan4100软件进行分析.

2 结果

整个产卵过程中，动物并未出现产软壳卵、畸形卵等异常现象.两只母鸡中，2号鸡的产卵周期较为规律，但产卵周期明显偏长，且卵重较1号鸡轻5g左右；1号鸡的产卵周期无明显规律，但产量略高于2号鸡.从第55天开始两只鸡产卵量明显减少，且产卵周期较不规律.

ELISA 评估了免疫前后各批次卵黄抗体效价变化情况，发现随着免疫时间的增加，卵黄中抗体含量逐渐增加，冻融法、水稀释法和PEG 法3种抽提法中抗体含量的变化趋势大致相同，但个别阶段的含量依然存在较大的波动（图1）.前10d的抗体含量普遍较低，随后快速增加，到40～60d抗体含量达到最高值，之后呈现逐渐降低趋势.根据ELISA 检测结果，可以发现5种蛇毒与卵黄IgY 的交叉反应程度也不同（图1）.其中，短尾蝮与IgY 免疫反应强度在第10天左右就开始快速增加，其余4种蛇毒与IgY 反应出现的时间大致相同，均在第15天左右开始增加；除冻融法所得IgY 与短尾蝮和乌苏里蝮蛇毒出现较高的反应强度外，其它两种抽提法所得IgY 与蛇毒免疫反应的强度大体一致（图1）.3种抽提法所得抗体效果略有差异，且抗体含量并非呈现均匀的变化趋势，期间存在突然升高或降低的情况，但不影响总体趋势的判断，均可用Log Normal四参曲线公式拟合抗体IgY 免疫期间诱导量的变化趋势（图1）.

图1 免疫过程中鸡卵黄抗蛇毒IgY的动态变化Fig.1 The dynamic change of chicken egg yolk IgY against venoms during the immunization

SDS-PAGE结果显示，5种蛇毒蛋白的主要成分集中在中低分子量区域（约43～58，22～26kDa），此外还含有少量的高分子（约130kDa）和低分子（约14kDa）组分（图2A）.Western blot检测结果显示，实验制备的鸡卵黄抗蛇毒IgY 和5种蛇毒之间存在不同程度的免疫交叉反应，且反应区域与蛇毒分子量条带区相对应（图2B～D）.岩栖蝮、短尾蝮和乌苏里蝮3种蛇毒与IgY 的反应强度基本相似，其中，短尾蝮和乌苏里蝮蛇毒蛋白几乎所有条带呈现出强烈的免疫原性，岩栖蝮仅有少量蛇毒组分未呈现免疫原性，这些组分主要集中在低分子量条带区（约14～25kDa），3种抽提法所得抗体与这3种蛇毒反应的效果接近.原矛头蝮和菜花原矛头蝮与IgY 也表现出相似的反应强度，但与前3种蛇毒相比，这两种蛇毒显示出较低的免疫原性，仅有少数蛋白条带能被IgY 抗体识别.且不同抽提法所得IgY 抗体对原矛头蝮和菜花原矛头蝮蛇毒的识别能力也存在差异，冻融法与水稀释法所得抗体可识别原矛头蝮蛇毒中约20、25、45和130kDa的组分，而PEG 法只能识别位于分子量约45和130kDa区域的蛋白条带.3种抽提法所得IgY抗体与5种蛇毒的反应显示，分子量约45和130kDa附近的蛇毒组分可被抗体有效识别，且表现较高的识别强度.

图2 Western blot检测鸡卵黄抗蛇毒IgY与5种蛇毒免疫反应Fig.2 Cross-reaction between egg yolk IgY and venoms from five species by western blot

3 讨论

本研究所用两只莱航母鸡的产卵规律存在一定差异，这可能与动物自身状态存在一定差异有关.实验期间，一只母鸡状态良好，另一只则稍显精神不济、鸡冠略有下垂，但无明显病症.两只鸡产卵周期不同，都存在明显的断档期.笔者发现，饲养期间两只鸡摄取饲料都不是很积极，对产卵造成一定影响；加之后期更换了饲料，造成其不适，产卵数量下降明显；此外，母鸡在注射蛇毒类毒素后存在一定的不适性，也可能影响产卵.这对后期的实验造成一定影响，因此在抗体提取过程中，人为设置周期合并鸡卵，以弥补上述缺陷.

用蛇毒类毒素免疫产卵母鸡可诱导出相应的抗蛇毒免疫蛋白，由于卵黄沉积作用，可在产出的鸡卵中检出这些抗蛇毒免疫蛋白，且连续对母鸡进行加强免疫，可使抗蛇毒免疫蛋白诱导量保持稳定水平［20］.本研究中由5种蛇毒混合物制备的类毒素免疫莱航母鸡被证实可诱导出卵黄多价抗蝮蛇毒IgY.ELISA 结果显示前10d抗体含量较低，这是由于动物接受免疫时间较短，对抗原的免疫应答还未明显体现出来.第11、21和31天进行了加强免疫，免疫效果明显，抗体含量快速增加，40～60d达到最高峰；之后因为停止免疫，故鸡卵黄中的抗体含量逐渐减少.实验所得的卵黄抗蛇毒IgY 对不同种蛇毒的识别能力存在一定差异.短尾蝮蛇毒诱导IgY 抗体的速度与含量要明显优于其它4种蛇毒，考虑到实验所用的类毒素是由5种蛇毒等质量混合的，因此可以推测蛇毒对莱航母鸡的免疫刺激应存在较大的种间差异.此外，亚洲蝮属（短尾蝮、乌苏里蝮和岩栖蝮蛇）蛇毒对母鸡的免疫刺激要强于原矛头蝮属（原矛头蝮和菜花原矛头蝮）蛇毒，表明蛇毒对母鸡的免疫刺激存在属间差异.

Western blot结果发现3种抽提法所得抗体对蛇毒的识别效果基本相似，仅有原矛头蝮和菜花原矛头蝮蛇毒部分条带（约20、25kDa）只能被冻融法和水稀释法所得抗体识别，而无法被PEG 法所得抗体识别，这可能是因为PEG 法在提取抗体过程中，体系比较粘稠，在离心管和透析袋上残留过多，导致相应抗体成分的损耗.Western blot结果表明蛇毒与IgY 反应存在显著的属间差异，且亚洲蝮属蛇毒的反应强度明显高于原矛头蝮属蛇毒，印证了与ELISA 检测相同的结论，可见母鸡对亚洲蝮属蛇毒的免疫应答要强于原矛头蝮属蛇毒.亲缘关系较近物种蛇毒间具有较多的共同抗原组分，所诱导出的抗体能够识别相近物种中较多的蛇毒组分［19］.用短尾蝮蛇毒制备的国产商用抗蝮蛇毒血清能较大程度地识别短尾蝮、乌苏里蝮和岩栖蝮3种蛇毒中的主要组分，但仅能识别原矛头蝮蛇毒中约14、20、40～50和130kDa区域的组分［21］，可见原矛头蝮蛇毒中其它分子量区域与蝮蛇毒不具有共同抗原组分.因此，本研究中5种蛇毒可被IgY 共同识别的组分（约45和130kDa），表明两属毒蛇的蛇毒仅少量组分具有共同的抗原表观识别位点，可诱导出共同抗体.另一方面，western blot结果显示，原矛头蝮属蛇毒中大量组分无法被IgY 识别，可能还意味着这些组分不易或无法引起莱航母鸡的免疫应答.

根据上述抗原抗体免疫反应的结果，可初步推断本研究制备之卵黄多价抗蛇毒IgY 与传统多价抗蛇毒血清具有相似的作用特点，但对不同蛇毒的作用存在较大的属间差异.对于亚洲蝮属3种毒蛇来说，在无法明确患者受何种咬伤时，这种卵黄多价抗蛇毒IgY 可能具有潜在的应用价值；对原矛头蝮属两种毒蛇来说，由于这种卵黄多价抗蛇毒IgY 对两种蛇毒识别能力较弱，其应用价值要低得多，仍有待进一步改进.此外，对于卵黄抗体IgY 的实际应用，可能还要较多地考虑到患者的过敏反应，这还将涉及IgY 的改造等工序，需要深入展开相关研究.

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