VEGF－C与VEGFR－3在喉癌组织中的表达及其与肿瘤转移的关系

夏 冰， 赵 军， 王乃会， 冯 剑， 董伟达

(1.南通大学附属建湖医院耳鼻咽喉头颈外科， 江苏 建湖 224700 2.江 苏 省 人 民 医 院， 江苏 南京 210029)

VEGF－C与VEGFR－3在喉癌组织中的表达及其与肿瘤转移的关系

夏 冰1， 赵 军1， 王乃会1， 冯 剑1， 董伟达2

(1.南通大学附属建湖医院耳鼻咽喉头颈外科， 江苏 建湖 224700 2.江 苏 省 人 民 医 院， 江苏 南京 210029)

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF－C)及其受体(VEGFR－3)在喉癌组织中的表达及其与喉癌临床病理特征的关系。方法:选取2012年5月至2014年5月在我院接受手术治疗的喉癌患者30例并提取患者喉癌组织及癌旁组织，以及30例健康体检者的正常组织。采用免疫组化染色法检测VEGF－C和VEGFR－3在不同组织中的表达情况。结果:VEGF－C与VEGFR－3在喉癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织和正常组织(P＜0.01);VEGF－C与VEGFR－3在喉癌组织中的表达强度与临床分期和淋巴结转移有关(P＜0.05);与肿瘤大小、病理分级等无关(P＞0.05);VEGF－C和VEGFR－3在喉癌组织中的表达呈正相关(r=0.899，P＜0.01);淋巴管密度(LVD)随VEGF－C和VEGFR－3表达增强而升高(F=9.833，P＜0.01)。结论:VEGF－C、VEGFR－3在喉癌组织中的异常表达可能与肿瘤转移有关。

喉 癌; 血管内皮生长因子C; 血管内皮生长因子受体; 淋巴管密度

喉癌(Laryngeal carcinoma)是耳鼻喉－头颈外科常见的恶性肿瘤之一，近年来的发病发病率和复发率持续升高。喉癌可以采取手术治疗、放化疗及生物免疫治疗，虽然可以缓解病情，但远期疗效并不理想，患者的生存质量没有获得明显改善［1］。目前普遍认为，临床分期是影响喉癌患者预后的主要因素。但有研究表明，淋巴管生成在恶性淋巴侵袭和转移过程中起重要作用［2］。血管内皮生长因子C(VEGF－C)及其受体(VEGFR－3)的异常表达可促进血管内皮细胞的生成，刺激淋巴管扩张［3］。为了探究VEGF－C和VEGFR－3的表达与喉癌临床特征的关系，本研究采用免疫组化法检测喉癌组织中VEGF－C、VEGFR－3的表达情况，为预防喉癌的复发转移提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料:选取2012年5月至2014年5月在我院手术的30例喉癌患者的肿瘤组织、癌旁组织(距肿离瘤切缘＞0.5cm)，所有标本均经病理诊断证实为鳞状细胞癌，癌旁组织经病理证实为炎症和正常组织，患者术前均未接受过放化疗或其他治疗。选择同期我院接受手术治疗30例患者正常喉黏膜组织标本作为对照。

1.2 实验方法:应用免疫组织化学染色方法:所有标本经4%甲醛固定、石蜡包埋，常规4μm制成连续切片，用二甲苯脱去蜡、梯度乙醇脱水。用新鲜配置3%的甲醇过氧化氢处理;VEGF－C、VEGFR－3和D2－40均采用枸橼酸缓冲液修复抗原;加一抗(稀释浓度VEGF－C、VEGFR－3为1:100，D2－40为1:50)，加入山羊血清，4℃下孵育过夜;PBS冲洗，加二抗10min，三抗10min，PBS冲洗，加DAB液显色，加入苏木素复染，梯度乙醇水化、加入二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察细胞染色。

1.3 判定方法:由两位病理科医师在未知临床资料的情况下判定，将阳性着色细胞所占百分比与细胞着色强度结合进行判定，得出阳性率。①阳性细胞百分数为5个视野中阳性细胞的平均数占视野中细胞数的比例，阳性细胞率≤25%记为0分，26%～50%记为1分，51%～70%记为2分，＞70%记为3分。②按多数阳性细胞的染色强度计分:无色记为0分，多数阳性细胞呈浅棕黄记为1分，多数阳性细胞呈棕黄记为2分，多数阳性细胞呈棕褐记为3分，将以上两项积分相加:0分为阴性，＞0分为阳性，并计算阳性百分率。③D2－40阳性淋巴管判断标准及计数方法:参照Weidner方法进行微淋巴管计数，在高倍镜(400×)下观察并对淋巴管进行计数，每份计数4个视野，取其平均值为LVD (D2－40阳性脉管数/HP)。

1.4 统计学方法:数据采用SPSS13.0进行分析处理，计数资料用(±s)表示，采用χ2检验或t检验。应用Spearman等级相关分析进行相关性分析，以P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 VEGF－C与VEGFR－3在不同组织中的表达情况:VEGF－C与VEGFR－3在喉癌组织、癌旁组织及正常组织中都有表达(H=38.66，H=36.33，P＜0.01)。VEGF－C与VEGFR－3在喉癌组织中的阳性表达率分别为73.5%和72.1%，均显著高于癌旁组织和正常组织，差异具有统计学意义(χ2=32.06，P＜0.01;χ2=26.43，P＜0.01)。D2－40在喉癌组织中的表达为(8.14±3.21)，显著高于癌旁组织和正常组织，差异具有统计学意义(H=29.71，P＜0.01)。VEGF－C、VEGFR－3及D2－40在癌旁组织和正常组织中的表达无显著差异(t= 0.170，P＞0.05)。见表1。

表1 VEGF－C与VEGFR－3在喉癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达 n(%)

2.2 VEGF－C、VEGFR－3及D2－40的表达与喉癌病理特征的关系:30例喉癌标本中，男18例，女12例;吸烟量＞400支/年的患者为14例，≤400支/年的为8例;癌肿直径＞3cm的患者为24例，≤3cm的为6例;病理分级:G1级7例，G2级13例，G3级10例;跨声门型癌6例，声门上型癌12例，声门型癌12例;TNM期:Ⅰ期9例，Ⅱ期5例，Ⅲ期13例，Ⅳ期3例;淋巴转移22例，无淋巴转移8例。VEGF－C、VEGFR－3及D2－40的表达与临床分期、淋巴转移及临床分型有关(P＜0.05)，与病理分级、吸烟史、肿瘤的大小和性别无关(P＞0.05)，见表2。

表2 VEGF－C与VEGFR－3在喉癌组织中的表达水平与临床病理之间的关系

2.3 VEGF－C、VEGFR－3和 LVD的相关性分析: Spearman相关分析显示，VEGF－C与VEGFR－3两者表达率呈正相关(r=0.899，P＜0.01)。多元线性回归分析显示，LVD表达水平与VEGF－C和VEGFR－3呈正相关，而且随VEGF－C与VEGFR－3表达增强而升高，差异具有统计学意义(YD=0.692XC+0.561XR－0.0663，F=9.833，P＜0.01)。

3 讨 论

VEGF－C是用Flt4亲和层析法分离得到与肝素结合的生长因子，可以促使血管内皮细胞分裂、增殖，促进新生血管的形成［4］。VEGFR－3是酪氨酸蛋白激酶家族受体，属于VEGF－C特异性受体，主要位于淋巴管的内皮细胞［5］。D2－40是一种淋巴管内皮细胞标记物，可以特异地与癌胚抗原M2A结合［6］。

在正常情况下，淋巴管内皮细胞为静止状态，而在外伤、炎症或者肿瘤情况下，淋巴管内皮细胞会迁移至局部组织并在生长因子作用下形成淋巴管［7］。癌细胞侵入到淋巴管被认为是基于增强癌细胞的侵袭性或是癌细胞产生消化酶对其基质破坏，恶性肿瘤细胞产生的VEGF－C与VEGFR－3结合后快速产生磷酸化，诱导胞质内信号的传导，使DNA有丝分裂旺盛，引起淋巴管内皮细胞增生，同时使淋巴管的通透性增强，因此肿瘤淋巴道转移的可能性也随之增加。此外，恶性肿瘤细胞通过侵袭周边病灶的淋巴管系统而进入淋巴液，进而形成淋巴结转移［8］。

大量研究表明，VEGF－C在多种肿瘤组织中比正常组织表达高［9］。有研究者在35个肿瘤标本中共检测到19个标本具有VEGF－C mRNA的表达。还有研究证实，LVD可以作为乳腺癌、胃癌和口腔鳞状细胞癌等肿瘤淋巴管生成的重要指标。近年来研究表明，VEGF－C及其受体VEGFR－3在癌组织中的高表达与LVD及淋巴结转移呈现正相关性。

结合本研究，VEGF－C与VEGFR－3在喉癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织和正常组织，差异具有统计学意义(P＜0.01)。我们推测，VEGF－C和VEGFR－3的表达与喉癌转移有关。研究还显示，D2－40在喉癌组织中的表达为显著高于癌旁组织和正常组织，差异具有统计学意义(H=29.71，P＜0.01)。结果提示，D2－40可能参与喉癌的发生和发展。此外，我们发现VEGF－C与VEGFR－3在喉癌组织中的表达呈正相关。说明VEGF－C和VEGFR－3的表达与肿瘤大小、病理分级、吸烟量及性别无相关性。这提示我们，VEGF－C可能通过多条信号通路激活活淋巴上皮细胞内膜上的受体而引起肿瘤细胞淋巴管的增生。

我们推测，肿瘤细胞可能通过旁分泌途径分泌VEGF－C，并与淋巴管内皮细胞上相关受体结合，使VEGFR－3酪氨酸酶产生磷酸化，导致肿瘤周围淋巴管生成和扩张，增加肿瘤转移扩散的可能性。因此，深入研究淋巴管内皮特异性标记物D2－40，并通过阻断VEGF－C和VEGFR－3信号传导通路表达，可能会成为阻断癌细胞经淋巴道转移的重要手段。但这一机制还需要我们在今后的实践中深入探索。

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Expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in Laryngeal Carcinoma and its Relationship with the Metastasis

XIA Bing， ZHAO Jun， WANG Naihui， et al
(Jianhu Hospital Affiliated to Nantong University，Jiangsu Jianhu224700，China)

Laryngeal carcinoma; VEGF－C; VEGFR－3; Lymphatic vessel density

B

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.05.026

1006－6233(2015)05－0785－04

Abstract:Objective:To investigate the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in the tissues of laryngeal carcinoma and its relationship with the clinical pathology of tumor.Method:The tissues of laryngeal carcinoma and para－carcinoma of patients with laryngeal carcinoma treated in our hospital from May 2012 to 2014 were selected.And another 30 normal tissues of the healthy people were chosen as the control group.Then the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in different tissues were detected by immunohistochemical staining method.Result:The positive expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in the laryngeal carcinoma were significantly higher than those of the tissues in para－carcinoma and the control group(P＜0.01);The expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in laryngeal carcinoma were related to the clinical stages and lymph node metastasis(P＞0.05).There was no relevance of the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 with tumor size or pathological grades(P＜0.05);There was positive correlation between the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in laryngeal carcinoma(r=0.899，P＜0.01);with the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 upregulating，the LVD increasing(F=9.833，P＆lt;0.01).Conclusion:The abnormal expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in laryngeal carcinoma may be associated with tumor metastasis.