匹伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

尤 杨， 冯 倩， 夏 岳， 戚国庆， 杨志瑜

(1.河北医科大学第一医院心内三科， 河北 石家庄 050031 2.河北省张家口市第一医院心内三科， 河北 张家口 075000)

匹伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

尤 杨1， 冯 倩2， 夏 岳1， 戚国庆1， 杨志瑜1

(1.河北医科大学第一医院心内三科， 河北 石家庄 050031 2.河北省张家口市第一医院心内三科， 河北 张家口 075000)

目的:探讨匹伐他汀对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用，为他汀类药物在缺血再灌注心肌的临床应用上提供理论依据。方法:成年雄性SD大鼠42只随机分为假手术组(Sham组)、对照组(IR组)及实验组(Statin组)，每组14只。Sham组与IR组术前给予生理盐水2mL/d灌胃4周，Statin组给予匹伐他汀0.42mg·kg－1·d－1，溶解成2mL灌胃4周。制作大鼠心肌缺血－再灌注模型时假手术组冠状动脉下只穿线，不结扎，无缺血－再灌注发生。IR组、Statin组均结扎冠状动脉前降支(LAD)30min，再松解120min。术后检测血清中肌酸激酶同工酶(CK－MB)水平，用氯化三苯基四氮唑(TTC)及伊文氏蓝(Evans blue)双染色法测定各实验组心肌梗死面积及缺血区面积。结果:与Sham组相比，IR组、Statin组的血清CK－MB水平显著升高(P＜0.01);Statin组CK－MB升高水平低于IR组(P＜0.05)。I/R组、Statin组缺血区面积差别无统计学意义(P＞0.05)。与I/R组相比，Statin组梗死面积显著减小(P＜0.05)。结论:匹伐他汀可以减少缺血再灌注后心肌梗死面积，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。

心肌缺血再灌注损伤; 匹伐他汀; CK－MB; 心肌梗死面积

目前再灌注治疗已广泛应用于各种急慢性心肌缺血人群，尤其是对于急性心肌梗死患者，尽早开通梗死相关动脉，迅速恢复梗死相关动脉的前向血流，可以挽救濒临死亡的心肌、限制梗塞面积、保护心肌泵功能、改善预后。然而近年来研究发现再灌注治疗可使缺血心肌在一定时间内恢复血液再灌注，但原心功能不仅没有恢复，反而出现了功能代谢障碍及结构破坏进一步加重的现象，即心肌缺血再灌注损伤(MIRI)［1］。他汀类药物是目前临床上应用最广泛的调脂药物，且在防治心肌缺血再灌注损伤的研究中，他汀类药物显示出不同时段、不同机制的心脏保护作用，本实验选用第三代他汀药物“匹伐他汀”，制作匹伐他汀预处理的大鼠心肌缺血－再灌注模型，观察匹伐他汀预处理对大鼠心肌梗死面积的影响，并进一步探讨其对心肌缺血再灌注损伤的影响及机制，为他汀类药物在干预缺血再灌注心肌的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料:实验动物:实验用成年雄性清洁级SD大鼠，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号:医动字第04038，动物等级:无特定病原体动物。主要试剂:肌酸激酶同工酶(CK－MB)检测试剂(河北医科大学第一医院检验科);伊文思蓝(Evans blue美国Sigma公司);氯化三苯基四氮唑(TTC美国 Sigma公司); 10%水合氯醛(河北医科大学临床医学院中心实验室);10%福尔马林溶液(河北医科大学临床医学院中心实验室);匹伐他汀片剂:(2mg/片，日本兴和株式会社)。主要仪器:ECG－9620P三道自动分析心电图机(上海光电医用电子仪器有限公司);HX－3实验用人工呼吸机(正达实验仪器开发公司);手术器械、7/0 Prolene线(河北医科大学第一医院手术室);电子天平(德国Sartorius AG公司);SBHW－IV电热恒温水浴箱(北京市医疗设备厂);LDZ5－2型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂);－20℃冰箱(青岛伊莱克斯有限公司);UNICEL DXC800全自动生化分析仪(德国BECKMAN COULTER公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制作:参考文献［2，3］的方法:经10%水合氯醛以3mL/kg腹腔注射麻醉，气管插管，接人工呼吸机。实验大鼠四肢皮下均插入针式电极，将电极尾端连接于心电图相应的肢体导联线上，选取Ⅱ导联作为记录导联，记录正常心电图(纸速 100mm/s，电压20mm/mV)对照。开胸，暴露左心耳与肺动脉圆锥之间的心大静脉，并以此血管为标志，结扎冠状动脉前降支(LAD)。先在结扎线下放一根lmm的乳胶管，结扎过程中严密监测心肌颜色改变，如心肌颜色变深，则结扎松紧度相对适宜。将LAD结扎30min，然后松线120min。模型制作成功标准:结扎LAD后左室前壁局部心肌立刻由鲜红立即变深、紫绀，心电图显示ST段弓背向上抬高≥0.2mV，T波电压增高，或QRS波幅升高及时限增宽;松开结扎线恢复冠脉血流，缺血部位心肌颜色恢复，T波迅速回落、ST段骤降50%以上提示冠状动脉成功再通。

1.2.2 动物分组:SD大鼠共42只，随机分为3组，术前3个组均于每日上午8:30～9:30，25℃室温下以生理盐水等量等温灌胃，每日1次。假手术组(Sham组，n=14):生理盐水2mL/d灌胃4周，术中LAD下只穿线，不结扎，无再灌注。缺血再灌注组(I/R组，n= 14):生理盐水2mL/d灌胃4周，术中结扎 LAD 30 min，再松解120 min。匹伐他汀组(Statin组，n=14):术前匹伐他汀0.42mg·kg－1·d－1用生理盐水溶解成2mL，每日1次，灌胃4周。

1.3 观测指标:①心电图;②CK－MB:各组随机抽取8只大鼠于实验结束时间点开腹，取静脉血1mL加入促凝管，室温静置离心后取上层血清，－20℃冰箱中保存，用UNICEL DXC800全自动生化分析仪测定CKMB含量;③心肌梗死面积:各组余6只大鼠，于实验结束时间点原位结扎LAD，将1mL 5%Evans blue溶液注入左室内以标记缺血区(无蓝色)和非缺血区(蓝色)，待大鼠口唇青紫时迅速取左心室，取心尖端3mm厚心肌(垂直心室长轴方向)，其余心肌组织置于－20℃冰箱30min，自心尖向心底部取2mm厚切片5片(垂直心室长轴方向)，置于1%TTC溶液中，在37℃恒温水浴箱中避光孵浴10～15min以标记缺血区及梗死区，再以10%福尔马林溶液固定24h以增强染色颜色对比。选取朝向心尖部的切面为面积分析切面:蓝色为正常心肌，粉色为缺血心肌，灰白色为梗死心肌。用计算机分析软件测定梗死区面积(AN):梗死面积为心脏总梗死区面积占总危险区面积(AAR，即缺血区与梗死区面积之和)的百分比(AN/AAR)，危险区面积为危险区面积占左室面积(LV)的百分比(AAR/LV)。

1.4 统计学方法:应用SPSS13.0软件进行统计分析。数据以正态性齐性检验，正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间两两比较采用q检验;非正态分布的计数资料用中位数表示，比较采用秩和检验。P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 心电图变化:结扎LAD前大鼠Ⅱ导联心电图显示心律齐，无ST－T及QRS波的改变;成功结扎LAD后，心电图出现ST段弓背向上抬高≥0.2mV，伴或不伴T波高尖，新发病理性Q波或原q波加深，QRS波群增宽;再灌注后出现T波迅速回落、ST段下降≥50%，再灌注时记录有房室传导阻滞、室性心动过速、心室颤动等再灌注心律失常发生。

2.2 血清CK－MB水平比较:与假手术组比较，IR组、Statin组的血清CK－MB水平升高显著(P＜0.01)，Statin组CK－MB升高水平低于IR组(P＜0.05)。见表1。

2.3 心肌梗死面积的比较:IR组、Statin组AAR/LV差别无统计学意义(P＞0.05)。与IR组相比，Statin组梗死面积显著减少(P＜0.01)，具有统计学意义。(见表2)。

表1 血清CK－MB水平比较(±s，n=8)

表1 血清CK－MB水平比较(±s，n=8)

注:与假手术组比较，*P＜0.01;与IR组比较，#P＜0.05

假手术组(IU/L)缺血再灌注组(IU/L)匹伐他汀组(IU/L) CK－MB 19.88±3.60 84.25±9.25* 76.88±5.82*#

表2 心肌梗死面积的比较(±s)

表2 心肌梗死面积的比较(±s)

注:与I/R组比较，*P＞0.05，#P＜0.01

部位 组别缺血再灌注组 匹伐他汀组P AAR/LV(%) 37.31±5.05 36.49±3.65* 0.754*AN/AAR(%) 65.44±7.61 48.57±9.14# 0.006#

3 讨 论

目前临床上心肌缺血再灌注治疗可使缺血相关冠状动脉尽早、最大程度地持久开通，恢复有效的冠状动脉前向血流，缩小心肌梗死面积，抑制心室重构，保护心肌功能，提高此类患者的存活率，改善预后。但目前临床工作中常可观察到再灌注治疗后反而出现了心律失常、心肌顿抑、心肌细胞坏死以及与内皮细胞及微血管功能障碍相关的“无复流”现象。CK－MB是一种存在于心肌细胞内的蛋白酶，当心肌细胞受损时，这种蛋白酶便可通过受损的细胞释放到血液中，故外周血血清中CK－MB水平变化可以作为反映心肌细胞坏死程度的较敏感指标。他汀类药物是目前临床上常用的调脂药物，目前多项临床试验均已证实长期应用他汀类药物可减少冠脉事件的发生，尤其是急性心肌梗死早期缺血相关事件的发生。本实验结果显示:经过匹伐他汀预处理后的大鼠与单纯缺血再灌注组大鼠比较，血清CK－MB升高程度显著降低，而心肌梗死面积也显著减小，说明匹伐他汀预处理可以明显减轻缺血再灌注心肌损伤。近年来，国内外多项他汀类药物相关研究发现:大鼠心肌缺血前给予相应的预处理方案，经历了再灌注后其心肌梗死面积显著减少，且减少幅度可能与他汀类药物的使用存在剂量依赖性。

因为目前他汀类药物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制尚不明确，推测可能与他汀类药物的多途径心脏保护作用有关。大量临床试验研究证明，他汀类药物的降胆固醇作用，可显著降低冠心病一级和二级预防中各类冠状动脉事件的发生率，也可在二级预防中降低全因死亡率［4］。另外，他汀类药物还存在强大的独立于调脂作用之外的其它保护作用，即他汀类药物的多效性。他汀的非降脂作用包括:改善血管内皮功能［5］、抗炎［6］、抗氧化应激［7］、抗血小板聚集和抑制血栓形成［8］、抑制心脏电生理重构、调节心脏植物神经功能［9］等。最近研究还发现他汀类药物可以明显减轻MIRI［10～12］。他汀类抗心肌缺血再灌注损伤是通过NO实现的［13，14］。Tavackoli等［15］选用辛伐他汀给大鼠进行预处理3d后制作I/R模型，结果显示辛伐他汀预处理组心肌梗死范围较单纯I/R组显著减小。短期阿托伐他汀治疗能明显减少I/R心肌梗死面积，降低血清CK、LDH水平，减轻大鼠心肌I/R损伤，使经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后患者血中可溶性细胞黏附因子－1水平降低，对防止PTCA后细胞黏附、血管再闭塞起一定作用。他汀类药物还可以破坏氧化应激，降低还原型辅酶活性、抑制核因子(NF)－κB、活性氧、髓过氧化物酶、白细胞的粘附和活性及炎症介质的表达，上调抗氧化酶活性，从而降低炎症反应;另外，此类药物可抑制人体内皮细胞RhoA蛋白的活性、抑制RhoA蛋白向细胞膜的转录，增加NO的产生和释放，抑制动脉粥样硬化和内膜增生进程，发挥其对心肌及血管的保护作用。

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The Positive Role of Pitavastatin in Prevention of Ischemia－reperfusion Myocardial Injury

YOU Yang， et al
(The First Hospital of Hebei Medical University，Hebei Shijiazhuang050031，China)

Objective:To explore the positive role of pitavastain in a rat model of myocardial ischemiareperfusion，provide a theoretical basis for pitavastain clinical application in myocardial ischemia－reperfusion.Method:A total of 42 male SD rats were randomly assigned to three groups:Sham group，control group(IR group)and experimental group(Statin group).In Sham group and control group，2mL saline were irrigated into stomach daily for 4 weeks，0.42mg/kg pitavastain dissolved in 2mL saline were given in experimental group.In surgery，we weared line under the coronary artery without ligation in Sham group，and ligated the line for 30 minutes and then released it for 120 minutes in IR group and Statin group.The levels of CK－MB were discerned after operation.Triphenyl tetrazolium chloride and Evans blue double staining method was used to determinat the myocardial infarct size and ischemic area in each experimental group.Result:The levels of CK－MB in control group and experimental group elevated significantly compared with Sham group(P＜0.01).The level of CK－MB in IR group was significantly higher than Statin group(P＜0.05).There was no significant difference in I/R and Statin group compared with ischemic area(P＞0.05).But when it comes to infarct size，it was more smaller in Statin group(P＜0.05).Conclusion:Pitavastatin couldreduce the cardiac infarct area and alleviate myocardial ischemia－reperfusion injury.

Myocardial ischemia－reperfusion injury; Pitavastatin; CK－MB; Cardiac infarct area

A

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.05.002

1006－6233(2015)05－0709－04

河北省科学技术研究与发展计划，(编号:112761155)