BRCA1 BRCA2在结直肠息肉和癌中的表达及临床意义

陈海滨， 张国志， 李曙光， 王长友

(河北联合大学附属医院普外科， 河北 唐山 063000)

BRCA1 BRCA2在结直肠息肉和癌中的表达及临床意义

陈海滨， 张国志*， 李曙光， 王长友

(河北联合大学附属医院普外科， 河北 唐山 063000)

目的:检测同源修复基因家族成员BRCA1、BRCA2在结直肠息肉和癌中的表达，探讨其与临床病理特征的关系。方法:利用免疫组化SP法分别检测27例正常结直肠粘膜、30例结直肠增生性息肉、33例结直肠腺瘤性息肉、60例结直肠腺癌组织中 BRCA1、BRCA2的表达水平。结果:BRCA1、BRCA2在正常结直肠粘膜、结直肠增生性息肉、结直肠腺瘤性息肉、结直肠癌组织中的表达率逐渐增高，差异有显著性(P＜0.05)，二者的表达与结直肠癌中的性别、年龄、分化程度、Ducks分期等均无统计学差异(P＞0.05);二者在结直肠癌组织中的表达水平呈正相关(r=0.295，P＜0.05)。结论:BRCA1、BRCA2表达呈正相关;二者可能参与结直肠癌的发生、发展;联合检测结直肠病变组织中的BRCA1蛋白、BRCA2蛋白的表达水平有助于大肠癌的早期发现。

结直肠增生性息肉; 结直肠腺瘤性息肉; 结直肠癌， BRCA1; BRCA2

结直肠癌是较常见的消化系统恶性肿瘤之一，其患者的生存率与肿瘤分期密切相关，多数患者就诊时已处于进展期［1］，因而病死率较高。BRCA1、BRCA2基因同为抑癌基因，在DNA损伤修复、细胞周期调节、基因转录激活、染色质稳定等方面发挥着重要作用［2，3］。有研究表明［4，5］，多种肿瘤细胞中均发现BRCA1的表达水平增高。本研究通过观察结直肠息肉和癌中BRCA1、BRCA2蛋白的表达水平，分析其与临床病理特征的关系，及二者在结直肠癌组织中表达水平的相关性，探讨联合检测BRCA1、BRCA2蛋白与结直肠癌发生、发展的关系及在其预防、治疗中的意义。

1 资料与方法

1.1 标本来源:标本均取自河北联合大学附属医院2012年7月至2014年7月间病理存档的石蜡标本(共150例患者)。60例手术患者术前均未接受过放、化疗，术后病理结果为腺癌，其中男性27例，女性33例，年龄34～80岁，平均年龄56.4岁;63例结直肠息肉患者，电子结肠镜下切除后均经病理证实:结直肠增生性息肉30例，结直肠腺瘤性息肉33例。另取27例结直肠外伤患者的正常粘膜组织做对照。

1.2 兔单抗BRCA1、BRCA2，DAB试剂均购于武汉博士德公司。

1.3 方法:免疫组化法:石蜡切片脱蜡至水;3%H2O2室温孵育5～10min;蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，再行微波抗原修复;5%～10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例(1:100)的一抗兔抗人BRCA1单克隆抗体(博士德公司)兔抗人、BRCA2单抗(1:100，博士德生物公司)50～100μl覆盖组织，4℃过夜;PBS冲洗，5min×3次;滴加适当比例稀释的生物素标记二抗工作液37℃孵育30min;PBS冲洗，5min×3次;滴加1～2滴辣根酶标记链霉卵白素37℃孵育30min;PBS冲洗，5min×3次; DAB显色剂显色;自来水充分冲洗，复染，封片。同种控制一抗条件尽量相同，每例至少染3张切片。

1.4 判断方法:结果判定:在5个高倍视野下进行计数，随机计数200个细胞中的阳性细胞所占比例，依据阳性细胞数进行计数。BRCA1和BRCA2阳性细胞表现为细胞核和细胞浆内出现棕黄色或棕红色颗粒，阳性细胞数≤10%为阴性表达，阳性细胞数＞10%为阳性表达。

1.5 统计学处理:采用SPSS13.0统计分析软件，计数资料进行χ2检验;相关性分析采用非参数Spearman秩相关检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同结直肠组织BRCA1蛋白、BRCA2蛋白表达:BRCA1在正常大肠黏膜中无表达，在增生性息肉、腺瘤性息肉及结直肠癌中的表达依次为26.7%、54.5%、71.7%，差异有统计学意义(χ2=15.32，P＜0.01)。BRCA2在正常大肠黏膜中无表达，在增生性息肉、腺瘤性息肉及结直肠癌中的表达依次为23.3%、45.5%、65.0%，差异有统计学意义(χ2=44.74，P＜0.05)。见表1。

表1 BRCA1 BRCA2在结直肠息肉和癌中的表达

图1

2.2 BRCA1蛋白、BRCA2蛋白的表达与结直肠癌临床病理特征的关系:两者蛋白表达水平与性别、年龄、分化程度、Ducks分期等均无统计学差异(P＞0.05)。在低分化、Dukes分期C和D期和淋巴结转移各组中，BRCA1蛋白阳性表达率分别为80.0%、70.8%和72.1%;在高分化、Dukes分期A和B期及无淋巴转移各组中，BRCA1蛋白阳性表达率分别为16.7%、33.3%和41.2%，三组中BRCA1蛋白阳性表达率呈递增趋势，但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。在溃疡型、Dukes分期C和D期和远端转移各组中，BRCA2蛋白阳性表达率分别为54.2%、68.8%和45.2%;在肿块型、Dukes分期A和B期及无远端转移各组中，BRCA2蛋白阳性表达率分别为23.1%、58.3%和17.2%，三组中BRCA2蛋白阳性表达率呈递增趋势，但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 结直肠癌组织中BRCA1蛋白、BRCA2蛋白表达的相关性分析:BRCA1蛋白与BRCA2蛋白均阴性者为31.7%(19/60)，BRCA2蛋白在BRCA1蛋白阴性表达中的表达率为 86.4%(19/22)，BRCA1蛋白与BRCA2蛋白均阳性者为26.7%(16/60)，BRCA2蛋白在BRCA1蛋白阳性表达中的表达率为42.1%(16/ 38)，统计学分析r=0.295，P=0.022，两者的表达呈正相关，见表3。

表3 BRCA1、BRCA2在癌组织中表达的相关性 (n)

3 讨 论

结肠癌的发生、发展和转移机制尚未完全阐释，大多认为是多种癌基因与抑癌基因相互作用的结果，是多因素、多步骤及长时间作用的过程。DNA的损伤是恶性肿瘤发生的重要原因之一，在DNA分子中存在的多种形式的损伤中，DNA的双链断裂(double－strand break，DSB)是DNA最为严重的损伤形式，如果不能得到及时而准确地修复，它可能会导致基因的突变、基因组的不稳定、细胞的染色体的丢失和重组或者导致细胞的凋亡甚至癌变。有研究发现［6］，大肠癌患者集中的断裂位点为1p32－tem、4p12－G12、4p31、5G21～31、7p15、14G22～24，染色体的这些位点携带着多个癌基因、抑癌基因、生长因子基因如 L－myc MTS1、p73、MCC、APC等。同源重组(homologous recombination，HR)是哺乳动物细胞修复 DNA双链断裂(doubles strand breaks，DSBS)的一种重要方式，高度保真的HR对维持基因组的稳定性起着至关重要的作用。在DNA进行复制的过程当中，当双链DNA中的一条链发生损伤时，由于该损伤的部位是不能成为修复模板的，因为不能根据它来合成互补的DNA链，所以会产生DNA链缺口，而从原来DNA链的对应部位切割出一段相应的部分来填补所产生的缺口，从而产生出了完整而且没有损伤的子代DNA的这种修复途径，就是同源重组修复途径。研究表明同源重组相关分子缺陷或者过表达与肿瘤的发生有关。当大肠癌相关基因损伤后BRCA1蛋白、BRCA2蛋白和其他分子共同感应DNA损伤，并将损伤信号传递到下游基因，由此启动HR参与DNA损伤修复。

本文所有病例的临床病理学特征均已得到证实，通过观察150例结直肠良恶性病变患者组织BRCA1、BRCA2蛋白的阳性表达率，发现两种蛋白的阳性表达率分别随着大肠病变恶性度的增加呈递增趋势，二者的高表达与结直肠腺瘤性息肉的大小及有蒂无蒂有关，在结直肠癌中的阳性表达率与分化程度、Ducks分期、淋巴结转移等均无统计学差异，但二者的表达在结直肠癌组织中呈明显正相关。BRCA1、BRCA2的表达与结直肠癌的临床病理特征无相关性，可能与标本来源的局限性及标本数量不足有关。二者随着结直肠病变的恶性度升高而呈递增趋势，我们可以推测在结直肠病变的发生、发展过程中HR通路激活，进而导致BRCA1蛋白、BRCA1蛋白的表达增加。

因此，联合检测结直肠病变组织中的BRCA1蛋白、BRCA2蛋白的表达水平有助于大肠癌的早期发现。通过探讨二者的表达规律，从而为结直肠良、恶性疾病的危险评估、检测及预防提供参考，并且有可能为结直肠癌的基因治疗提供新的途径。目前，真核生物HR途径的研究也已逐步应用到了治疗肿瘤的领域中。二者在流行病学上有许多相似之处，本文表明二者在结直肠癌中的表达呈正相关，暗示它们的mRNA表达受到协调调控。这两种蛋白的基因定位和mRNA编码已经清楚，但其完整的基因结构及其蛋白质功能尚不完全清楚，其与其它肿瘤广泛的相关性也需要进一步研究。

［1］汪露，江滨.大肠癌筛查方法研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2014，5:236～239.

［2］Vollebergh MA，Jonkers J，Linn SC.Genomic instability in breast and ovarian cancers:translation into clinical predictive biomarkers［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69(2):223～245.

［3］Roy R，Chun J，Powell SN.BRCA1 and BRCA2:different roles in a common pathway of genome protection［J］.Nat Rev Cancer，2012，12(1):68～78.

［4］Qiao G B，Wu Y Y，Yang X N，et al.High－level expression of Rad51 is an independent progostic marker of survival in non－small－cell lung cancer patient［J］.Br Cancer，2005，93 (1):137～143.

［5］Soderlund K，Skoog L，Fornander T，et al.The BRCA1/ BRCA2/Rad51 complex is a prognostic and predictive factor in early breast cancer［J］.Radiother Oncol，2007，84 (3):242～251.

［6］邵丽娜，来茂德.结直肠癌染色体断裂率的研究［J］.第四军医大学学报，2000，1:72～75.

Expression of Colorectal Polyp and Cancer BRCA1 BRCA2 and the Clinical Significance

CHEN Haibin， ZHANG Guozhi， LI Shuguang， WANG Changyu
(The Affiliated Hospital of Hebei United University，Hebei Tangshan063000，China)

Objective:To detect members of the family of homologous repair genes BRCA1 and BRCA2 expression in colorectal polyps and cancer，to explore its relationship with the clinical pathological features.Method:By using immunohistochemical SP method detected 27 cases of normal colorectal mucosa，30 cases of colorectal hyperplastic polyp，33 cases of colorectal adenomas sex polyp，60 cases of colorectal adenocarcinoma tissue protein BRCA1 and BRCA2 protein expression，analysed the physical index and the correlation with colorectal polyps and cancer.Result:BRCA1 and BRCA2 in normal colorectal mucosa，colorectal hyperplastic polyp，colorectal adenomas polyps and colorectal cancer expression rate increased gradually in the organization，and had significant difference(P＜0.05)，the expression in colorectal cancer such as sex，age，degree of differentiation，Ducks stage had no statistical difference(P＞0.05)，both in the tissue of colorectal cancer expression level significantly positively correlated(r=0.295，P＜0.05).Conclusion:Expression of BRCA1 and BRCA2 are positively correlated，both may participate in the occurrence and development of colorectal polyps and cancer.Joint detection of colorectal lesions in the organization the expression of BRCA1 protein and BRCA2 protein levels for early detection of colorectal cancer.

Colorectal hyperplastic polyp; Colorectal adenomas sex polyp; Colorectal cancer，BRCA1;BRCA2

B

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.05.019

1006－6233(2015)05－0763－05

* 通讯作者