武汉地区157 例乙型肝炎病毒基因分型和耐药性分析

宋仕玲，桂文甲，周洪清，黄艺芬，尹淑芬，李 靖，吴淑坤

武警湖北总队医院感染科，湖北 武汉430061

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因型测定对评估慢性乙型肝炎感染者的疾病进展和制定最佳抗病毒治疗方案很重要，相比而言，肝硬化和原发性肝癌患者感染的乙型肝炎病毒基因分型更多为基因C型和D 型［1-3］。核苷(酸)类药物(nucleostide analogues，NAs)作为抗乙型肝炎病毒药物，广泛应用于乙型肝炎病毒所致各种慢性肝病的治疗，HBV 耐药是慢性乙型肝炎抗病毒治疗中的重要问题，了解HBV 耐药突变位点，有助于制定和调整慢性乙型肝炎感染者的抗病毒治疗措施［4］。本文对武汉地区157 例慢性乙型肝炎患者的HBV 基因型分布及其耐药性情况分析如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 筛选有完整基因分型的157 例武汉地区慢性乙型肝炎患者，其血清标本由深圳华大基因研究院于2011 年7 月-2013 年4 月收集，男130 例(82.80%)，女27 例(17.20%)，年龄17 ～73 岁，平均年龄(43.08 ±16.02)岁。诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010 年版本)》［5］。抽取外周静脉血5 ml，分离血清置-20 ℃存储备用。

1.2 仪器 PTC200 PCR 扩增仪(BioRad 公司)，ABI 3730 XL 测序仪(美国ABI 公司)，Tannon 1600 数码凝胶图像处理系统(Tannon 公司)，DYY-6C 型电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.3 试剂 北京天根生化科技有限公司TIANamp 病毒基因组DNA 提取试剂盒，大连Takara Taq 酶，大连TakaraDL2000 DNA Marker，大连Takara 随机引物(6 mer)，大连Takara dNTP Mixture(10 mm)，大连Takara Premix PrimerSTAR HS。

1.4 方法

1.4.1 HBV DNA 提取:严格按照TIANamp 病毒基因组DNA 提取试剂盒说明书操作提取DNA 溶液。

1.4.2 PCR 扩增:按照试剂盒操作说明书，将反应试剂和引物按照顺序依次加入EP 管内，震荡混匀后离心10 s，将配置好的PCR Mix 分装于96 孔板上，加入DNA 溶液，用封口膜封口，离心4 000 r/min，1 min，将标本置入PCR 扩增仪扩增进行PCR 反应。将5 μl PCR 产物和酶标板中2 μl Buffer 混合，将琼脂凝胶放入电泳槽，点样5 μl DL2000 DNA Marker 于琼脂凝胶中电泳。将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染液中，染色10 ～15 min，凝胶拍照成像。

1.4.3 将PCR 产物进行纯化处理:3730 XL 测序仪上进行测序检测，下机进行数据分析，解读下机数据，NCBI 在线基因分型工具(http://www. ncbi. nlm. nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)对上述所得序列进行对比，获得HBV 基因分型结果，分析耐药位点的突变情况，耐药位点出现突变峰则定性为产生变异，此位点出现耐药，生成检测报告。

1.4.4 HBV 基因型和耐药位点检测目标:共检测8个HBV 基因型，即A ～H 型。检测HBV 11 个耐药位点:rtL80、rtL169、rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtA194、rtS202、rtM204、rtN236 和rtM250。

1.5 HBV 耐药变异位点和核苷类似物之间关系判断 根据《乙型肝炎病毒耐药专家共识:2009 年更新》［6］，拉 米 夫 定 耐 药 相 关 变 异 为rtM204I/V ±rtL180M，其中rtM204V 多与rtL180M 变异联合出现，rtM204I 变异可单独出现;阿德福韦酯耐药相关变异为rtN236T 与rtA181V/T 变异，两个位点变异可单独或联合出现;恩替卡韦耐药相关变异为rtM204V +rtL180M变异基础上，再联合rtT184、rtS202 或rtM250 三个位点中至少一个位点的氨基酸替代变异;与替比夫定耐药相关变异为rtM204I。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件进行处理，计数资料比较采用χ2检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 157 例患者HBV 基因型结果 157 例患者共检测出3 种HBV 基因型，其中B 型114 例(72.61%)，C型42 例(26.75%)，D 型1 例(0.64%)。未测出A、E、F、G、H 型。

2.2 HBV 耐药性结果 157 例患者中共有68 例(43. 31%)耐药，其中B 型48 例，占耐药病例的70.59%，占B 型病例的42.11%;C 型20 例，占耐药病例的29.41%，占C 型病例的47.62%;统计学检测提示基因B 型和C 型的HBV 耐药发生相比，差异无统计学意义(χ2=0.379，P ＞0.05)。对拉米夫定耐药41例，占耐药病例的60.29%，其中B 型30 例(73.17%)，C 型11 例(26.83%);204I 位点耐药17 例(B 型14例，C 型3 例)，180M+204I 位点耐药6 例(B 型2 例，C 型4 例)，180M+204V 位点耐药12 例(B 型9 例，C型3 例)，180M +204V/I 位点耐药6 例(B 型5 例，C型1 例)。对阿德福韦酯耐药20 例，占耐药病例的29.41%，基因B 型15 例(75. 0%)，基因C 型5 例(25.0%);耐药位点为236T 9 例，均为基因B 型，耐药位点为181T/V 7 例，基因B 型4 例，基因C 型3 例，236T 和181T/V 联合耐药4 例，基因B 型和C 型各2例。对恩替卡韦耐药5 例，占耐药病例的7.35%，基因B 型3 例(耐药位点:180M +204V +184I +202G、180M+204V +202G、180M +204V/I +250V)，基因C型2 例(耐药位点:180M+204I +184I、180M+204V+184I+202G)。拉米夫定和阿德福韦酯联合耐药2 例，占耐药病例的2. 94%，均为基因C 型，耐药位点为180M+181I +204V、181T +204I。替比夫定耐药与其他核苷类似物耐药分析结果重复，共32 例(47.06%)，基因B 型24 例，基因C 型8 例;单独204I 位点变异17例，204I 位点联合其他位点变异15 例。

3 讨论

目前已经确定10 种HBV 基因型和超过30 种基因亚型分布于全球不同地区，依据HBV 全基因组核苷酸序列中核苷酸差异≥8%分为不同基因型［7］，4% ～8%的核苷酸差异分为不同基因亚型，除了已广为人知的A ～H 型外，两个新的基因型I 和J 已经被确认［8-9］。一项中国的HBV 基因型流行病学调查显示中国南方主要分布HBV 基因B 型，而北方多为基因C型［10］。刘艾芹等［11］检测深圳地区157 例CHB 患者基因型，发现基因B 型占61.53%，基因C 型占37.17%。而本研究检测华中地区的武汉市157 例患者，发现共检测出3 种HBV 基因型，基因B 型占72.61%，C 型占26.75%，D 型占0.64%，未测出A、E、F、G、H 型，提示武汉地区HBV 基因分型以B 型为主。

目前常用基因型耐药检测技术有PCR 产物直接测序、聚合酶链反应限制性片段长度多态性、反向杂交法、实时PCR、基因芯片、限制性片段质谱多态性技术，其中PCR 产物直接测序法可检测已知和可能的未知耐药变异位点，是最常用的基因型耐药检测方法之一［6］。本研究采用PCR 产物直接测序技术，研究结果发现157 例患者中共有68 例耐药，占43.31%，其中B型48 例，占耐药病例的70. 59%，占B 型病例的42.11%;C 型20 例，占耐药病例的29.41%，占C 型病例的47.62%，基因C 型和基因B 型HBV 相比，发生耐药的差异无统计学意义，这与其他研究结果不一致［10-11］。

拉米夫定是最早应用于临床的NAs 药物，临床使用广泛，但耐药率较高［6］。拉米夫定耐药发生机制为HBV DNA 聚合酶基因发生突变所致，以C 区的YMDD变异为主，表现形式为YIDD 或YVDD 变异［11］。本研究发现68 例耐药患者中对拉米夫定耐药最多，为60.29%，其中B 型30 例(73.17%)，C 型11 例(26.83%)。分析其耐药特点，表现为YIDD 变异即204I 位点耐药17 例(B 型14 例，C 型3 例)，表现为YVDD 和YMDD 变异共24 例，即180M +204I 位点耐药6 例(B 型2 例，C型4 例)、180M+204V 位点耐药12 例(B 型9 例，C 型3 例)、180M+204V/I 位点耐药6 例(B 型5 例，C 型1 例)。

阿德福韦酯常见耐药相关变异为rtN236T 和/或rtA181V/T 变异［6］。本研究结果显示68 例HBV 耐药患者中，对阿德福韦酯耐药20 例(占29.41%)，其中以基因B 型为主(75.0%)。耐药位点为236T 9 例，均为基因B 型;耐药位点为181T/V 7 例，基因B 型4例，基因C 型3 例;236T 和181T/V 联合耐药4 例，基因B 型和C 型各2 例。有研究［12］对比阿德福韦酯耐药的HBeAg 阳性慢性乙型肝炎患者选用替比夫定联合阿德福韦酯治疗(30 例)和恩替卡韦单药治疗(28例)的各项数据，治疗48 周后，两组患者HBV DNA 低于3 log10copies/ml 比率、病毒学突破和耐药发生情况相似，均无严重不良反应，但替比夫定联合阿德福韦酯组有6 例(20%)患者出现HBeAg 血清学转换，恩替卡韦组未出现HBeAg 血清学转换。

恩替卡韦的抗病毒作用强、耐药变异发生率低［5］，HBV 基因组需要至少3 个位点发生变异才会对恩替卡韦耐药，其1 ～5 年累计耐药发生率分别为0.2%、0.5%、1.2%、1.2%与1.2%［6］。本研究显示68 例耐药患者中对恩替卡韦耐药发生率较低，共5例，占7.35%，基因B 型3 例，基因C 型2 例。

替比夫定常见耐药相关变异为rtM204I，其他位点尚存在争议［6］。本研究68 例HBV 耐药患者中，替比夫定耐药共32 例，其中基因B 型24 例，基因C 型8例。单独204I 位点变异17 例，204I 位点联合其他位点变异15 例。有研究［13］对比替比夫定和恩替卡韦治疗乙肝代偿期肝硬化2 年，结果发现恩替卡韦降低HBV DNA 至检测不到水平及病毒耐药情况都显著好于替比夫定组，两种药物对降低HBsAg 水平、肝细胞癌发展、病死率、疾病进展和肾功能变化方面都有相似作用，对于需要终生治疗患者不宜将替比夫定作为一线药物。

综上所述，本研究结果发现157 例患者中基因B型最多，其次为基因C 型，发现1 例基因D 型，68 例耐药患者其HBV 对拉米夫定和替比夫定耐药率较高。了解慢性HBV 感染者的HBV 基因型和HBV 耐药突变情况，有助于初步预测病情变化，为患者制定科学化个体治疗方案。

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