根管预备对粪肠球菌感染根管形成细菌渗漏的影响＊

赵 洁，曹祥莉，钟晓波

（重庆医科大学附属口腔医院牙体牙髓科/口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室 401147）

运用常规根管治疗方法后仍迁延不愈的慢性根尖周炎（难治性根尖周炎）或根管治疗后病变未愈合或出现新的根尖周病变（根管治疗后疾病）是牙体牙髓科医生倍感棘手的难题。研究发现，约35%的根管治疗后出现根管治疗后疾病，有根管治疗后疾病的患牙再次根管治疗的成功率为40%～85%。其主要因为来源于感染根管的细菌形成了根尖生物膜［1］，因此，防止细菌穿出根尖孔形成细菌渗漏是预防根尖生物膜的主要途径之一，从而减少根管治疗后疾病的发生。有学者认为，感染根管内的细菌以生物膜的形式存在，在未接受治疗时，细菌不易穿出根尖孔，根管治疗打破了根管内生物膜的平衡，扩增的浮游细菌增加了细菌穿出根尖孔的机会，或治疗本身直接推出根尖孔的细菌，在躲避了机体免疫机制后形成了根尖生物膜，从而形成难治性根尖周炎和根管治疗后疾病［2－3］。本课题小组的前期研究显示，对于暴露在空气中所形成的感染根管，根管下段以下的预备对细菌渗漏的形成有促进作用。本文进一步研究根管预备对难治性根尖周炎的优势细菌［4－5］——粪肠球菌形成细菌渗漏的影响，为临床预防根尖生物膜的形成提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 PCR仪（德国Eppendorf公司），电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像仪（美国Bio－Rad公司），K锉、流动树脂（美国DENTSPLY公司），细菌DNA提取试剂盒（Tiangen公司），2×Master Mix（大连 Takara公司），引物（上海生物工程公司），粪肠球菌（ATCC 29212）。

1.2 方法

1.2.1 离体牙纳入标准 选取患者因正畸减数拔除的单根前磨牙，年龄14～25岁，根尖孔发育完全，无龋坏、根尖周炎及牙周疾病，无根裂、根折或牙根吸收等明显的牙体组织缺陷。用刮匙去除牙根表面软组织和牙石，利用游标卡尺测量牙体长度：颊尖顶端至解剖根尖孔长度的基础上减去1mm。在100 mL/L甲醛溶液中室温保存备用。

1.2.2 粪肠球菌感染根管－根尖周组织复合体体外模型的建立 按照王容等［6］所建立的方法制作模型20个，抽取10个作为实验组进行开髓后接种粪肠球菌，于建模后21d通过16SrRNA通用引物PCR法及粪肠球菌特异16SrRNA引物检测根尖周组织及根管内细菌。若对照组根尖周检测到细菌则说明模型制备不成功，重新制作模型；若对照组根尖周未检测到细菌，而实验组根管内也只检测到粪肠球菌则说明建模成功。

1.2.3 根管预备对粪肠球菌感染根管－根尖周生物膜形成的影响 同样方法建立模型310个，分为对照组（A组n＝70）、实验组（n＝240）。实验组做开髓处理后接种粪肠球菌，对照组不做任何处理。全部置于三气培养箱（含5%O2，85%N2，10%CO2；温度37℃）中，于21d随机抽取10个对照组模型通过16SrRNA通用引物PCR法检测根尖周组织细菌，确定建模成功后，对实验组通过相应干扰进行分组，髓腔干扰组即B组（n＝60）、根管上2/3受干扰组即C组（n＝60）、全长受干扰组即D组（n＝60）及超长干扰组即E组（n＝60）。之后放入三气培养箱（含5%O2，85%N2，10%CO2；温度37℃）中。5组分别于干扰后1、7、21、35、49、63d进行PCR检测（期间每2天用灭菌针管通过开髓孔滴入新鲜灭菌液态BHI培养基）。根据结果利用SEM进行Ef根尖生物膜观察并对根尖周细菌进行细菌培养。

表1 用于本研究的预期PCR引物，扩增子的大小和热循环参数

1.2.4 样本采集及检测 样本采集：在超净工作台中，取下固定有离体牙的青霉素瓶塞，之后收集根尖周BHI固态培养基于装有1mL双蒸水的1.5mL灭菌离心管中，震荡30s后吸取100μL洗脱液作细菌培养，其余洗脱液置－20℃冰箱保存待检。样本检测：样本室温下解冻后，提取DNA，严格按照细菌DNA提取试剂盒说明书提取样本中细菌DNA。电泳：PCR扩增体系见表1，扩增产物用2.0%的琼脂糖凝胶检测。

细菌培养方法：在超净工作台中，利用灭菌接种环沾取样本根尖周区域可见白色菌膜的琼脂培养基，之后用三段分区划线法将细菌接种于预先灭菌的BHI琼脂培养皿中，注意每一段均需灭菌接种环。之后放置培养皿于三气培养箱（含5%O2，85%N2，10%CO2；温度37℃）中。

2 结 果

2.1 细菌检测 将提取出的根尖周细菌总DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经2.0%的琼脂糖凝胶检测。建模后接种粪肠球菌，21d时 A、B、C、D、E 5组根尖区样本均未扩增出16SrDNA通用引物片段，见图1a。根管预备干扰后1d，E组根尖区样本扩增出粪肠球菌16SrDNA特异性引物片段，其余各组均未检测到，见图1b。根管预备干扰后7d，D组根尖区样本亦扩增出粪肠球菌16SrDNA特异性引物片段，A组、B组及C组仍未检测到，见图1c。根管预备干扰后21、35、49、63 d，A、B、C组均未检测到，见图1d。图1中阳性对照组、双蒸水空白对照组为PCR特有的对照组。

2.2 根尖周生物膜电镜扫描结果 对根尖区扩增出粪肠球菌16SrDNA特异性引物片段的样本进行扫描电镜观察。结果显示，D组中根尖区粪肠球菌呈团状附着于根壁，菌体被无定性基质包裹形成生物膜结构。A组则明显无任何细菌附着。见图2。

图1 根尖区样本PCR扩增产物电泳图

图2 根尖区样本电镜扫描图片

2.3 细菌培养 对检测到细菌的D、E组进行根尖周细菌培 养，两组各10个样本，结果显示，均为粪肠球菌活菌且无杂菌，见图3。

图3 细菌培养结果

3 讨 论

研究显示，难治性根尖周炎及根管治疗后疾病的原因主要是根尖生物膜的形成［7－8］。而对于牙周健康的患牙，根尖生物膜的细菌则来源于感染根管［9－10］。有学者通过研究拔除的患牙发现，未经治疗的慢性根尖周炎患牙，在根尖周不易检出根尖生物膜的存在，而经过治疗的患牙，反而容易检出根尖生物膜［11－12］，提示根管治疗本身，因打破了根管内细菌生物膜的平衡，增加了细菌穿出根尖孔导致细菌渗漏的可能。

本实验将粪肠球菌接种于体外模型中的离体牙根管中，待形成感染根管（21d）后对其进行根管预备干扰［13］。同时应用PCR具有特异性及敏感性的粪肠球菌引物检测其16SrDNA来鉴别，快速，灵敏度高［14］。但因PCR并不能说明细菌的活性，因此在实验最后进行细菌培养，从而验证根尖周粪肠球菌生物膜为活菌，进一步证明实验的可行性及准确性。

在根管预备前检测A、B、C、D、E组根尖周均未检测粪肠球菌；预备后1d时，E组根尖周即检测到粪肠球菌；7d时，D组检测到粪肠球菌，而A、B、C组根尖周在所有检查时间点均未检测到粪肠球菌。推测原因，超长预备，器械穿出了根尖孔，可将细菌直接推出根尖孔；全长预备，临近根尖孔的生物膜受到干扰，增加的浮游细菌容易穿出根尖孔；而根管上2/3预备，增加的游离细菌距离根尖孔有距离，不易穿出根尖孔，因而在根尖周未发现细菌。

对于机体，有免疫机制的存在，即使细菌穿出了根尖孔，并不意味着它就能存活、生长繁殖并形成生物膜［15］。机体免疫机制对细菌渗漏的影响，是今后进一步研究的课题。

本实验结果提示，在不考虑免疫机制的情况下，超出根尖孔的预备和根管下段的预备对细菌渗漏甚至细菌生物膜的形成有促进作用，为根管治疗后疾病及难治性根尖周炎埋下隐患。因此对于可能存在免疫缺陷者感染根管，在实际临床操作中，可先行根管上2/3预备并封药消毒，以减少细菌量及其活性。再行根管全长预备并避免器械超出根尖孔。或可一定程度上预防细菌穿出根尖孔造成细菌渗漏，从而减少难治性根尖周炎及根管治疗后疾病的发生。

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