GSK－3β、Snail和E－cadherin在三阴乳腺癌组织中的表达及临床意义＊

高双全，肖高芳△，高双荣，王林辉，丁 宇，杜日昌

（1.韶关市粤北人民医院病理科，广东韶关512026；2.中国中医科学院中药研究所，北京100029）

三阴乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）表现为雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子 受体 2（human epidermal growth factor receptor－2，Her－2）表达均缺失的一种特殊类型的乳腺癌［1］，占全部乳腺癌的13.7%～23.8%［2］，具有发病年龄轻、侵袭性高、易复发转移、生存期短及预后差等特点，严重威胁了患者的生命。临床上，TNBC对内分泌治疗不敏感，化疗是目前惟一的全身性治疗方法，但预后较差。因此寻求有效的治疗方法已成为当今研究的热点。有研究表明，TNBC较非TNBC更容易发生上皮间质转化（EMT），从而增加肿瘤细胞的侵袭性和恶性程度，而Snail、糖原合成酶激酶3（GSK－3β）和E－钙黏着蛋白（E－cadherin）均参与了EMT过程。因此，本文拟比较TNBC与非TNBC中Snail、GSK－3β和E－cadherin的表达的差异，对全面评价TNBC的预后具有重要意义，可能为TNBC的基因靶向治疗提供实验基础和依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择韶关市粤北人民医院于2006年9月至2013年9月收治的48例TNBC患者作为观察对象即TNBC组，随机选出60例非TNBC患者作为对照即NTNBC组（ER、PR或HER－2为阳性），所有病例均有完整的临床病理资料。

1.2 主要试剂 兔抗人单克隆抗体Snail（Santa Cruz公司，美国）、E－cadherin（Abcam 公司，美国）。兔 抗人单克隆 抗 体GSK－3β（Santa Cruz公司，美国），免疫组织化学和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。GSK－3β抗体的工作浓度为1∶50，Snail与E－cadherin抗体的工作浓度为1∶100。

1.3 方法 石蜡包埋的乳腺癌组织标本，经4μm连续切片后进行免疫组织化学染色。按SP法免疫组织化学检测试剂盒说明书检测乳腺癌样本中GSK－3β、Snail和E－cadherin的表达。用已知的阳性片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.4 判断标准 GSK－3β阳性结果为细胞质染成棕黄色，阳性细胞数小于10%为阴性，≥10%为阳性。Snail主要定位于细胞核，其中阳性细胞数小于30%为阴性，≥30%为阳性。E－cadherin主要定位于细胞膜，阳性细胞数小于10%为阴性，≥10%为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析，计数资料用率表示采用χ2检验分析，GSK－3β、Snail和 E－cadherin表达相关性分析采用Spearman等级相关性分析；生存时间等预后指标用Kaplan－Meier法分析，用Log－Rank检验进行相关曲线的统计学检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床指标比较与NTNBC组相比，TNBC组患者腋窝淋巴结转移率升高（43.75%vs.25.00%），比较差异有统计学意义（P＜0.05）。NTNBC组和TNBC组患者肿瘤大小均以2.0～5.0cm多见，组织学类型均以浸润性导管癌最常见，但两组在患者年龄、肿瘤大小及组织学类型方面差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 TNBC组和NTNBC组患者的临床病理因素比较［n（%）］

2.2 两组患者 GSK－3β、Snail和 E－cadherin的表达情况比较 本研究结果显示，TNBC组 GSK－3β的阳性表达率（54.17%）明显高于 NTNBC组（25.00%），差异有统计学意义（P＜0.01）；TNBC组Snail的阳性表达率（43.75%）显著高于NTNBC组（31.67%），差异有统计学意义（P＜0.05）；TNBC组E－cadherin的阳性表达率（22.92%）显著低于 NTNBC组（46.67%），差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图1。

表2 两组患者 GSK－3β、Snail和E－cadherin的表达情况比较［n（%）］

2.3 TNBC中GSK－3β表达与Snail和E－cadherin表达的相关性 48例TNBC组织中GSK－3β和Snail同时表达阳性16例（33.3%）；GSK－3β 和 Snail同时表达阴性15例（31.3%）。GSK－3β表达与Snail表达呈正相关（r＝0.296，P＜0.05）。48例TNBC组织中GSK－3β和E－cadherin同时表达阳性3例（6.3%）；GSK－3β和 E－cadherin同时表达阴性14例（29.2%）。GSK－3β表达与E－cadherin表达呈负相关（r＝－0.294，P＜0.05）。

A：GSK－3β在TNBC中的阳性表达；B：Snail在NTNBC中的阳性表达；C：E－cadherin在NTNBC中的阳性表达。

3 讨 论

TNBC较NTNBC更容易发生EMT，使上皮细胞失去极性及与基底膜连接的上皮表型特征，从而获得高迁移、侵袭及降解细胞外基质的表型特征［3］。EMT的发生与多种蛋白分子有关。

E－cadherin是维持上皮表型的重要黏附分子，E－cadherin减少或缺失时，会导致肿瘤的过度增长和外向侵袭。有研究报道，E－cadherin表达阴性患者的预后明显较阳性患者差［4］。E－cadherin的下调或缺失是发生EMT的重要标志［5］。增加E－cadherin表达、抑制Wnt通路可促进上皮分化并抑制EMT的过程［6］。本研究显示，TNBC中E－cadherin较NTNBC表达明显降低，在E－cadherin阴性的样本中Snail、GSK－3β明显增高，说明E－cadherin下调对TNBC低分化、高侵袭性发挥着重要作用。

GSK－3β是糖原合成酶激酶3的一个亚型，参与PI3－Kinase、Wnt/β－catenin及 Hedgehog信号转导、细胞增殖和肿瘤发生等过程［7］，在细胞周期S期，GSK－3β水平最高，在凋亡早期，GSK－3β在细胞核内迅速增加［8］。Wnt信号是参与乳腺浸润性导管癌浸润行为的关键通路，GSK－3β在Wnt通路中与E－cadherin、Slug、β－连 环 蛋 白（β－catenin）共 同 参与了 EMT 过程［9］。本研究发现，在TNBC中GSK－3β表达较NTNBC明显增高。因此，其是参与浸润性乳腺癌的EMT过程中 Wnt/βcatenin信号通路的关键成分，GSK－3β持续高表达伴随E－cadherin表达缺失与TNBC高侵袭性、低生存期密切相关。

Snail是近年发现的锌指转录因子，是肿瘤细胞EMT过程中的关键调节者［10］，其高表达和E－cadherin低表达，在肿瘤细胞浸润、迁移过程中发挥着重要作用［11］。研究发现，Snail可作为乳腺癌的独立负性诊断指标［12］，即Snail高表达，则乳腺癌分化差，侵袭性强，易转移，生存期短。Côme等［13］发现乳腺癌组织中Snail、Slug高表达能抑制E－cadherin启动子，导致其部分表达或完全缺失，且Snail、Slug在乳腺浸润性导管癌中高表达与淋巴结转移密切相关。本研究显示，TNBC中Snail较NTNBC中的表达水平明显增高，在E－cadherin阴性表达样本中的阳性表达率显著高于E－cadherin阳性表达组，与Côme等［13］的结果一致，表明Snail表达与E－cadherin呈负相关，TNBC更具有强浸润、迁移能力，并易于发生淋巴结转移。

综上所述，TNBC中 GSK3β、Snail高表达、E－cadherin部分表达或完全缺如，与乳腺癌高侵袭性、易转移、生存期短密切相关，联合检测 GSK3β、Snail、E－cadherin的表达，对判断 TNBC的复发转移及预后有重要的意义。

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