黄粉虫中氨基脲的含量测定与来源分析

刘丽丽，刘 谦，鹿 宁，刘晓慧

（保定出入境检验检疫局，河北 保定 071051）

黄粉虫俗称“面包虫”，其幼虫富含蛋白质、矿物质和多种微量元素，素有“动物蛋白饲料之王”的称誉。在传统应用中，黄粉虫作为宠物饲料主要是用于特种养殖，将鲜活或干虫用于饲养蝎子、金钱龟、观赏鱼类、鸟类、蛙类、蛇类等一些经济价值较高的特种经济动物，能加快生长发育，提高抗病免疫能力，降低饲料成本，提高经济效益[1]。近年来，黄粉虫逐渐作为饲料添加剂应用于畜禽养殖业，在加快动物生长速度，扩大繁殖量，增强抗病力，提高存活率等方面作用显著。另外有研究表明，黄粉虫虫蜕中提取的甲壳素的质量优于虾蟹壳中甲壳素的质量，因为其碳酸盐含量低、色素少[2]，其出口量也在逐年增加，市场前景广阔。在河北省保定地区一次出口黄粉虫饲料风险监控中，发现其氨基脲含量超标。

氨基脲是一种联胺类小分子化合物，通常被认为是禁用药物呋喃西林的代谢产物。动物源性食品中氨基脲的残留通常是由于在动物养殖过程中使用了呋喃西林后代谢产生的[3]。目前，很多国家都以检测呋喃西林代谢产物-氨基脲判断是否在养殖过程中非法使用了呋喃西林，以达到对呋喃西林原药监控的目的。欧盟、日本及中国[4]先后规定呋喃西林及代谢物在动物源性食品中不得检出。然而，2014 年在一次出口黄粉虫饲料风险监控中，发现其氨基脲含量超标。尤其是黄粉虫干品，阳性率高达100%。有研究表明，呋喃西林并非是氨基脲的惟一来源。非动物源性食品中的氨基脲主要来源有发泡剂偶氮酰胺和食品添加剂卡拉胶的使用，而甲壳类水产品中的氨基脲则作为内源性物质存在于甲壳类水产动物体中[5-6]。为了调查黄粉虫氨基脲超标的原因，本试验通过对黄粉虫饲料，黄粉虫幼虫，虫蛹，成虫以及虫蜕和肉中氨基脲含量的研究，证实了氨基脲自然存在于黄粉虫体内；属内源性物质，此研究结果从根本上解释了黄粉虫中氨基脲超标的原因，为黄粉虫中氨基脲的残留研究提供了技术支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂 Waters 2695 高效液相色谱仪，Waters TQD串联四极杆质谱仪（ESI 源）；梅特勒天平；PHS-3C雷磁精密pH 计；3-30K 高速离心机（SIGMA公司）；SHA-B恒温振荡器（常州国华电器有限公司），EYELA氮吹仪，EYELA旋转蒸发仪；氨基脲盐酸盐和氨基脲同位素标准品（纯度≥99%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司）；甲醇、乙酸乙酯、正己烷（色谱纯，天津科密欧公司）；二甲基亚砜、2-硝基苯甲醛、盐酸、氢氧化钠、磷酸氢二钾（分析纯，天津科密欧公司）；样品定溶液：10 mL 乙腈0.1 mL 甲酸用水定容100 mL；衍生剂：0.0375 g 2-硝基苯甲醛用5 mL 二甲亚砜溶解。

1.2 样品前处理方法 准确称取样品1.0 g（蜕皮取0.5 g）（精确到0.01 g）于50 mL 离心管中，加入50 μL（1 μg/mL）内标工作液，涡旋混合30 s，加入10 mL 0.2 mol/L 盐酸溶液和150 μL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋30 s 后，置于37 ℃恒温水浴振荡器中避光振荡16 h。取出离心管冷却至室温，加5 mL 1.0 mol/L 磷酸氢二钾溶液混匀后，用1 mol/L NaOH 溶液调pH 值至7.2 左右；加入15 mL 乙酸乙酯，涡旋60 s，以10 000 r/min 离心5 min，取上层清液至100 mL 鸡心瓶中，加入10 mL 乙酸乙酯重复提起1次，合并提取液，于40 ℃水浴下旋转蒸发至干。准确加入1.0 mL 样品定溶液和2 mL 正已烷，涡旋混合1 min；倒入5 mL 玻璃离心管中，以2 000 r/min离心5min，取下层溶液过0.22 μm 滤膜，供液相色谱串联质谱测定。

1.3 标准曲线的制备 取干净50 mL 离心管添加氨基脲浓度分别为20、50、100、200、500、1 000 μg/kg 内标50 μL，衍生剂150 μL 处理步骤同1.2。

1.4 液相色谱-质谱分析条件

1.4.1 液相色谱条件 色谱柱：CNWC18，100A，5 μm，150 mm×2.1 mm(内径)；流动相：洗脱程序见表1；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；气帘气：50 L/h；雾化气：800 L/h；离子源温度：120 ℃；定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞能量见表2。

表2 质谱参数

2 结果与讨论

2.1 前处理条件 按照GB/T 20752-2006 对黄粉虫各日龄段干品进行处理时，由于黄粉虫干品经粉碎机粉碎后，成粉末状，在进行固相萃取极容易堵塞固相萃取柱，过柱及抽干时间较长。本方法通过乙酸乙酯液液萃取，高速离心，有效避免了堵塞萃取柱的问题，同时缩短了前处理时间，提高了工作效率。

2.2 方法线性范围 按1.3 节的方法配制标准工作液，经液相色谱串联质谱测定后，以浓度为横坐标，氨基脲峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线。试验表明，氨基脲浓度在20～1 000 ng/mL 范围内与其峰面积比值呈良好的线性关系，回归方程为y=0.1884x+0.1534，r=0.9998。

2.3 检出限 通过空白基质添加0.5 μg/kg 氨基脲经1.2 处理后进行检测，回收率和精密度符合GB/T27404-2008 的要求，故检出限为0.5 μg/kg。

2.4 黄粉虫饲料及各阶段干品中氨基脲的含量见表3，各日龄段黄粉虫及虫蜕和肉中氨基脲定量离子流图见图1。

图1 各日龄段黄粉虫和虫蜕以及肉中氨基脲定量离子流图

由表3 可以看出，黄粉虫肉中氨基脲含量甚微，饲料中完全不含氨基脲，但随着黄粉虫日龄的增长，氨基脲的含量呈明显的上升趋势，特别是从幼虫变成虫蛹，氨基脲的含量大幅增加，虫蜕中氨基脲的含量比幼虫中氨基脲的含量高很多。

表3 黄粉虫饲料及各阶段干品氨基脲含量

3 结论

通过对黄粉虫饲料，各日龄段幼虫干品、蛹、成虫、蜕皮以及黄粉虫肉进行氨基脲的检测，确定黄粉虫饲料中不含氨基脲，黄粉虫各日龄段氨基脲含量都很高，而蜕皮氨基脲含量比幼虫含量高很多，这可能跟黄粉虫生长后期，身体外壳逐渐变硬，甲壳素含量增加（与河虾，雄蜂蛹相类似）有关。因此将黄粉虫中氨基脲定性为内源性物质，为黄粉虫中氨基脲的残留分析提供了技术支撑。

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