甘油磷酸胆碱制备及纯化技术研究进展

鹿保鑫，张文喆

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

甘油磷酸胆碱制备及纯化技术研究进展

鹿保鑫，张文喆

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

甘油磷酸胆碱因具有降低高血脂、改善老年人的记忆和认知能力、治疗阿尔茨海默症和修复脑神经损伤病等效用，使其备受科学界的关注，对甘油磷酸胆碱的研究越来越广泛。现对甘油磷酸胆碱的生物学意义、制备及纯化技术的研究现状进行了系统概述，希望为甘油磷酸胆碱产业化生产提供有力依据。

甘油磷酸胆碱；生物学意义；制备；纯化

甘油磷酸胆碱（Glycerophosphorylcholine，alpha-GPC，简称GPC）是由磷脂分子上两条脂肪酸链水解后的产物，是一种人体内卵磷脂的分解代谢产物[1]，它是由磷酰基、甘油、胆碱三部分组成[2-3]，分子量为257.22，其分子式为C8H2ONO6P。甘油磷酸胆碱的比旋度是-2.4～-2.8，高纯度的甘油磷酸胆碱呈白色粉末状或无色透明粘稠油状，具有较强的极性，易溶于水及极性溶剂，在人体内多呈水溶性磷脂代谢产物[4]。需要在2～10℃下，避光、避热，并且需要在通风干燥处密封保存。

甘油磷酸胆碱在磷脂合成和代谢中起着重要的作用，它不仅是磷脂代谢的一种中间产物，同时也是合成磷脂酰胆碱和乙酰胆碱的前体。人体内的甘油磷酸胆碱对提高认知能力[5]、维持荷尔蒙的正常水平[6]和GABA神经物质激活剂[7]均发挥着重要的作用。另外，甘油磷酸胆碱还具有降低高血脂、改善老年人的记忆和认知能力、治疗阿尔茨海默症[8]和修复脑神经损伤病等作用[9-10]。因此，甘油磷酸胆碱的研究受到了科学界的广泛重视，主要针对甘油磷酸胆碱的生物学意义、医学价值、制备及纯化技术进行概述。

1 甘油磷酸胆碱的生物学意义

甘油磷酸胆碱不仅是肾髓质细胞的主要渗透物之一，而且能够平行的改变细胞内外渗透物质的浓度。这对于脑血管的健康，尤其是有益于因大脑衰退而引起的行为和情感障碍[11]。甘油磷酸胆碱具有对于多种生化病变进行治疗和预防的潜在能力[12]。研究人员发现它可以改变神经元膜中的磷酸盐类脂化合物结构，并且在引发神经组织衰退综合症的相关因素中发现它具有缓解身体紧张性的奇特功效[13]。甘油磷

酸胆碱的理化结构以及相互联系的理化特性，确保了它成为非常对脑组织有益的、能时刻保护脑组织新陈代谢的磷脂类物质[14]。乙酰胆碱可帮助脑部完成记忆、学习等活动。在体内，甘油磷酸胆碱可穿过血脑屏障，这种生理生化特性为乙酰胆碱的生物合成提供了必要的原料——胆碱[15]。“胆碱能损伤假说”，认为胆碱能的活性丧失与阿尔茨海默氏症的严重程度有关。

2 甘油磷酸胆碱的医学价值

甘油磷酸胆碱已经在意大利、波兰、希腊、智利、韩国、巴西、俄罗斯等国家上市[16]。它不仅能够提供脑细胞和神经细胞所需要的高水平胆碱，而且还能保护其细胞壁。阿尔兹海默症患者主要表现为记忆力与认知功能下降，并且伴有多种并发症，如行动不便、神经系统紊乱等功能性障碍。临床的药理学试验结果和临床试验都已证实甘油磷酸胆碱对大脑的认知能力和记忆功能大有帮助[13]。甘油磷酸胆碱可以延缓记忆力的衰退，对于脑部中风、颅与脑部损伤患者的康复与预防。由于年龄的增长而致使人脑的细胞膜受损，当体内乙酰胆碱和磷脂酰胆碱的合成数量增加了，情况就会得到改善[17]。

甘油磷酸胆碱能够进入脂蛋白结构中，它不仅可以口服还可以静脉注射。医药动力学研究证明，甘油磷酸胆碱能在静脉注射和小肠的位置被吸收，再经过血液循环进入到各个器官之中，并在肝脏中结合脂蛋白。它在青少年身体成长、保护肝脏、抗类风湿、改善老年人的认知能力、抗动脉硬化、抵抗高脂蛋白食物的脂肪渗透、提高记忆力等方面也具有一定的作用[18]。

2.1 甘油磷酸胆碱安全性特点

甘油磷酸胆碱是人体内的内源性物质，在2009年的《突变研究》杂志刊登了480种测试销售药物的遗致癌性和遗传毒性，甘油磷酸胆碱列于“没有检索到数据的药品”类。它不具有生殖毒性、遗传毒性和致癌性[19]。在对2 000多例患者进行临床前试验时，发现总共出现了不良反应40多例（2.14%），本品的临床不良症状主要有：胃有灼热感、兴奋、失眠、头痛和恶心；个别患者出现呕吐、腹泻、意识模糊、头晕、猝倒等症状；但总体看来甘油磷酸胆碱的安全性良好[20]。

2.2 甘油磷酸胆碱耐受性特点

根据多个中心的临床试验使用甘油磷酸胆碱对阿尔茨海默氏症和多发性脑梗死性痴呆[20]患者进行分别研究治疗。甘油磷酸胆碱治疗阿尔茨海默氏症疗程为180 d，每次0.4 g，每天服用3次药。结果显示，甘油磷酸胆碱治疗阿尔茨海默氏症疗效明显，并且患者对于甘油磷酸胆碱的耐受性较好[21]；甘油磷酸胆碱在治疗多发性脑梗死性痴呆方面的研究，在对120多例轻度病情的多发性脑梗死性痴呆患者进行试验，疗程为80 d，每同肌肉注射甘油磷酸胆碱1 g。结果显示甘油磷酸胆碱对于多发性脑梗死性痴呆效果显著，患者的耐受性较好[22]。使用甘油磷酸胆碱治疗脑缺血性中风、轻度多发性脑梗死型痴呆、轻度阿尔茨海默症，无局部或者全身的重大不良反应。没有临床上和统计上的生命体征（舒张压、收缩压和心率）也没有任何实验室检查参数的明显变化。所以，甘油磷酸胆碱的耐受性良好。

3 甘油磷酸胆碱的制备

最早的甘油磷酸胆碱是直接从牛的胰脏中提取得到的，这种方法比较原始，获取量比较小。目前国内外甘油磷酸胆碱的制备方法有直接萃取、冷却结晶法、有机溶剂萃取法、硅胶柱层析法、离子交换树脂法等方法。随着甘油磷酸胆碱药用、保健、临床价值的研究深入，研究人员发现了越来越多的甘油磷酸胆碱的制备方法，其中较具代表性的甘油磷酸胆碱制备方法包括：化学制备法及生物酶水解法。

3.1 化学制备法

3.1.1 化学合成法

从天然产物中分提纯化出甘油磷脂酰胆碱常存在难于纯化的技术问题，故部分研究人员采用化学合成技术用于制备甘油磷酸胆碱。

GPC的化学定向制备技术开始于1963年，Brockerhoff等[23]将磷脂溶于乙醚溶液在四丁基氢氧化铵为催化剂的条件下完成了甘油磷脂酰胆碱的制备。Song等[24]基于环氧开环反应原理，借助（R）-（+）缩合甘油（（R）-（+）Glycidol）与磷酸胆碱的亲核加成反应制备甘油磷脂酰胆碱。Park等[25]比对了两种以缩水甘油化学合成GPC的技术，分别为：（1）通过缩水甘油与对甲苯磺酸胆碱和吡啶反应生成（R）-缩水甘油磷酸胆碱，进而发生开环反应制备得到GPC；（2）（R）-缩水甘油与苯甲醇发生开环反应后经乙酰化、氢化作用后，与对甲基苯磺酸胆碱和吡啶反应，生成乙酰甘油磷酸胆碱，经去乙酰化制备得到GPC。近年来，陈新等[26]应用手性原料（S）-（-）-缩水甘油为底物

制备（2R）-（-）-缩水甘油对甲苯磺酸酯，而后通过缩合反应制备甘油磷酸胆碱。

Seok和Seob等[27]同样利用环氧开环反应原理，依据R-（+）-缩水甘油与磷脂酰胆碱氯化物在有机溶剂中进行加成反应，并以异丙胺、嘧啶或二乙胺稳定反应pH，通过结晶析出及离子交换色谱法制备高纯度的GPC。孙清瑞、鹿保鑫等[15]，研究了制备甘油磷酸胆碱的影响因素。应用磷脂酰胆碱为原料，反应时间为80 min，在20℃下，底物浓度为10%（m·v-1），催化剂甲醇0.75 v·m-1，进行静置反应前要使催化剂与反应溶液混合均匀，磷脂酰胆转化率在97%以上。

3.1.2 化学水解法

McArthur和Saskatoon等[28]以氯化汞为催化剂，在水相或醇相体系下催化卵磷脂水解制备GPC，体系中的汞离子采用沉淀法及离子交换树脂吸附法除去。Tattrie和McArthur[29]在上述制备技术的基础上，采用加热反应在醇相体系下制备GPC。两种方法因易存在汞离子残留问题，并且由于汞离子催化剂的应用使相应纯化工艺繁杂，故此技术在应用上受到限制。考虑到汞离子的残留问题，Tattrie和McArthur[30]提出了采用氯化镉替代氯化汞作为催化剂制备GPC，但这种技术在处理量上不尽如人意，且成本相对较高，不适于产业化生产应用。

Chadha[31]亦以蛋黄卵磷脂为底物，在CdCl2为催化剂的条件下进行醇解反应，纯化处理采用氯仿－甲醇溶液萃取法联合乙醚萃取法结晶制备GPC。但此种方法制备的GPC产品不能满足商业需求。Tronconi[32]以甲醇钠为催化剂催化大豆磷脂醇解，通过添加锌盐与GPC形成（nGPC）ZnX2复合物，而后添入嘧啶与锌盐复合，并以强阴离子交换树脂分离GPC，该技术中锌盐的分离会影响到GPC产品的制备纯度及产品得率，且该方法在制备过程中将会产生较多的废水。Gozzoli和Scolastico[33]则以高纯度的卵磷脂为底物，以甲醇钠催化脱酰作用制备出纯度和回收率较高的GPC。

3.2 生物酶水解法

由于溶剂萃取法、化学合成法、化学水解法在制备GPC的方法均存在部分的环境污染、成本过高、产品纯度低等问题。而伴随着生物技术的发展，生物酶解法逐渐成为GPC制备的新型技术，其具有环保、高效的特点，故成为现今GPC制备技术的研究热点。

生物酶水解法制备技术主要是借助磷脂酶酶解作用，并利用特定酰基受体和供体催化酯交换反应修饰改变磷脂结构，进而制备GPC、GPE及其他类似产品[34]。磷脂酶酶解磷脂制备GPC的反应是一类界面反应，磷脂酶反应发生在胶柱与水的临界面。反应界面的大小对酶反应速率的大小和水解程度有着直接的关系[35]。

F.Blasi等[36]考虑在微乳体系下采用磷脂酶A2和脂肪酶Lipozyme IM催化水解磷脂酰胆碱用于制备GPC，经测试产品制备率可达94%，但此技术存在耗时较长、成本偏高的问题。而钱峰等[37]利用磷脂酶A1催化磷脂酰胆碱水解制备GPC，经测试，GPC制备率近86%。为了降低成本及简化分离纯化步骤，毛慧芳等[38]以固定化酶技术将磷脂酶A1固定并用于磷脂酰胆碱酶解制备GPC，此技术GPC产率为85%。

张康逸等[39]利用磷脂酶A1在水相体系下酶解大豆粉末磷脂制备甘油磷酸胆碱，探讨了反应条件对磷脂酰胆碱的转化率和甘油磷酸胆碱得率的影响。在粉末磷脂添加量5 000 mg、CaCl2添加量500 mg、酶添加量0.50 mL，反应时间6 h，温度56℃条件下甘油磷酸胆碱得率达95%。并且验证了生成的溶血磷脂由Sn-2位的不饱和脂肪酸转移到了Sn-1位。

赵艳艳等[40]在非水相中用脂肪酶催化剂水解大豆卵磷脂生成甘油磷酸胆碱的研究，在反应温度40℃、反应时间7 h、加酶量12.5 mg·mL-1、pH 5.0、加水量5%条件下，适度补加底物，该方法甘油磷酸胆碱得率可达98%。

4 甘油磷酸胆碱的纯化

上述的多种GPC制备技术，均存在产品纯度低的问题，为了提高GPC产品的纯度，冷却重结晶法、离子交换树脂柱层析法、硅胶柱层析法、有机溶剂萃取法等一系列纯化技术响应逐渐出现，相关的GPC纯化制备技术的报道包括：

Reichling等[41]将磷脂粗品的反应液通过硅胶柱，应用甲醇和甲苯的混合溶液作为洗脱剂，依次洗脱制备甘油磷脂酰胆碱，但该方法产品生产成本偏高，且容易出现硅酸残留问题。Tronconi等[42]利用离子交换树脂法分离粗磷脂的水解产物，并从中分离出纯度较高的甘油磷脂胆碱及多类同步产品。

周丽，鹿保鑫等[43-44]，通过粉末磷脂水解获得甘油磷酸胆碱的混合物，探讨了三种树脂的吸附性，然后再用离子交换树脂分离甘油磷酸胆碱，再将得到的液体通过阴离子交换树脂的进一步纯化，再用HPLC分析所得产物，GPC的干基含量为97.11%。

5 结束语

随着我国老龄化问题的日益加剧，阿尔兹海默症患者将会不断增加，预计在本世纪中叶成为威胁人类健康最严重的疾病之一，不仅影响中老年人的身体健康和生活质量，同时也对我国经济社会的发展造成严重影响。因此，研发预防和治疗阿尔兹海默症的特效药物，已成为医药领域和生物工程领域的研究热点之一[36]。这也是磷脂研究工作者所面临的重要课题和契机。试验表明，甘油磷酸胆碱在治疗阿尔兹海默症方面，具有显著的疗效，并且副作用小，耐受性好。国内的胶囊剂和工业化生产尚属空白。因此，研发甘油磷酸胆碱，不仅可以满足广大阿尔兹海默症患者的治疗需要和预防此类病症的发生，而且可以获得巨大的经济效益，具有很好的市场前景。

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Review on Preparation and Purification Technology of Glycerol Phosphate Choline

Lu Baoxin，Zhang Wenzhe
（College of Food Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Glycerol phosphate choline can reduce the high blood cholesterol，improve memory and cognitive ability of the elder，have the treatment of Alzheimer's disease，and repair the utility of brain damage，which acquire the scientific community concern.So glycerophosphorylcholine has been studied widely.The biological significance，research status，preparation and purification technology of glycerol phosphate choline were summarized，and it provided the strong basis for industrial production of glycerol phosphate choline.

glycerol phosphate choline；biological significance；preparation；purification

TQ645.9

A

1002-2090（2015）02-0046-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2015.02.011

2014-06-13

黑龙江省农垦总局技术开发项目（HNK12KF-24）。

鹿保鑫（1972-），男，教授，黑龙江八一农垦大学毕业，现主要从事农产品加工方面的教学与研究工作。