大庆龙凤湿地底泥氨氧化细菌与氨氧化古菌多样性分析

马茹霞，晏磊，王国兴，王长虹，贾军，邓兵，沈婷婷，王伟东

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.上海岩土工程勘察设计研究院有限公司）

硝化作用在地球的氮素循环过程中起重要的作用，其主要包括两个步骤，第一步通过氨氧化菌将氨氧化为亚硝酸盐，第二步通过亚硝酸盐氧化菌将亚硝酸盐氧化为硝酸盐。其中，氨氧化细菌（Ammoniaoxidizing bacteria，AOB）介导的氨氧化作用是其限速步骤，主要由属于变形杆菌门的β-亚纲和γ-亚纲的氨氧化菌来完成[1]。AOB进行的氨氧化作用是由氨单加氧酶（ammoniamonooxygenase，AMO）催化的，编码AMO的基因（amo A，amo B和amo C）分别编码其3个亚基[2]。1997年，Rotthauwe首次使用amo A-PCR方法研究了自养氨氧化细菌群落结构[3]，此后，amo A基因被广泛运用于各种生态系统中自养氨氧化细菌的群落结构研究[3]。有研究发现 Nitrosomonas sp.和Nitrosospira sp.为一些堆肥过程中的关键AOB菌群[4]，由于Nitrosospira sp.生长速度较慢，目前在活性污泥中很少检测到[5]。研究发现，在海洋和陆地环境的一些嗜温和嗜热古菌中也含有amo A基因的同系物，并且能催化氨氧化反应[6-7]，这一发现将参与氮素循环的微生物扩展到了古菌领域。进一步研究表明，海洋中AOA的数量占了整个微生物数量的39%，这些AOA很有可能在海洋环境的硝化作用中起着重要的作用[8-9]。近期，第一株 AOA-Nitrosopumilu smaritimus的成功培养以及古菌amo A基因的mRNA对氨盐添加的响应[6]，强有力地证实了AOA在自然界中的真实存在。到目前为止，富集培养AOA已有4种Nitrosopumilu smaritimus[6]、Cenarchaeumsymbiosum[10]、Nitrososphaera gargensis[11]和 Nitrosocaldus yellowstonii[7]。最近，大量的研究发现属于泉古菌门的AOA也能氧化氨，广泛分布于土壤、河口沉积物、牛粪堆肥及污水处理厂等环境中[12]，自然界中AOA的多样性和功能研究迅速成为新的研究热点。

龙凤湿地位于黑龙江省大庆市，是全国最大的城市湿地，常年淹水，水来源于自然降水、嫩江引水和城市污水厂净化后的水，是典型的受人工干扰的湿地类型[13]。湿地生态系统对氨态氮有显著的截留和净化功能，而氨态氮是AOB和AOA进行氨氧化反应的底物，氮循环是湿地生态系统中最基本和重要的物质循环之一。实验分别以AOB和AOA的amo A功能基因为目标，构建其amo A基因克隆文库，研究龙凤湿地底泥中AOB和AOA的多样性，并对其底泥理化参数进行分析，以期为人工干扰型湿地氨氧化微生物研究提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 样品采集

样品采集于黑龙江省大庆市龙凤湿地的底泥（2013年10月31日），采用多点取样法，垂直取水下10～25 cm深的底泥，每个点取样量相同，混合均匀后装入灭菌的封口聚乙烯袋中迅速带回实验室，其中一部分样品用于理化参数的测定，另一部分存置于-20℃冰箱冻存用于后续DNA的提取。

1.2 实验方法

1.2.1 底泥理化参数的测定

底泥中盐分采用重量法测定，铵态氮采用靛酚蓝比色法测定，硝态氮采用酚二磺酸比色法测定，亚硝态氮采用重氮化偶合分光光度法测定，全氮采用开氏消煮法测定，全磷采用酸溶-抗比色法测定，全钾采用氢氟酸-高氯酸消煮-火焰光度法测定，上述测定方法见参考文献[14]。pH利用数字pH计（日本）测定。

1.2.2 样品总DNA的提取

取0.1 g底泥样品，利用改进的氯化苄法提取总DNA[15]，重复3次。为除去腐殖酸等杂质，将提取的DNA混合，纯化试剂盒纯化粗提的总DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 AOB amo A基因的PCR扩增

利用引物amo A-1F（5′-GGGGTTTCTACTGGTG GT-3′）和amo A-2R（5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCT T-C-3′）对AOB amo A基因进行扩增。PCR的反应体系为25μL体系：2.5μL 10×buffer，0.5μL 10 mM dNTP，0.5μL模板 DNA，1μL Taq DNA聚合酶（5 U），引物各0.25μL，加ddH2O补足至25μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，52℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃最后延伸5min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后用凝胶成像系统照相。

1.2.4 AOA amo A基因的PCR扩增

利用引物Arch-amo AF（5′-STAATGGTCTGGCT TAGACG-3′）和Arch-amo AR（5′-GCGGCCATCCAT CTGTATGT-3′）对AOA amo A基因进行扩增。PCR反应体系为 25μL体系：2.5μL 10×buffer，0.5μL 10 mM dNTP，0.5μL模板DNA，1μL Taq DNA聚合酶（5 U），引物各 0.25μL，加ddH2O补足至25μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃最后延伸5min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后用凝胶成像系统照相。

1.2.5 PCR产物的纯化与连接

每次PCR重复3次且设置阴性对照，PCR均停止于4℃，产物采用纯化试剂盒回收。

PCR连接反应体系为：PGEM-T Easy载体1μL，10×T4 DNA Ligation Buffer 5μL，PCR回收产物3μL，T4 DNA Ligase 1μL。轻弹离心管使混合均匀，16℃连接过夜。

早在1910年与1937年HARTMANN和JAUDON就提出低血糖是新生儿常见疾病，会造成神经系统损伤与危害[1],其危险因素与低体温、早产儿、低出生体质量儿、喂养不当、孕母糖尿病等有关[2]。研究亦报道新生儿低血糖症发病越早、程度越重、存在时间越长，越易造成新生儿智力低下、脑瘫等中枢神经系统的永久性损害[3]。因此,掌握新生儿血糖检测值在临床工作中尤为重要，对高危儿的血糖干预逐渐成为常规。而照顾新生儿的医护人员对于影响血糖值相关因素的认知，更与临床提供安全有效的高质量护理密切相关。

1.2.6 amo A基因克隆文库的构建

大肠杆菌感受态细胞100μL，置于冰浴中，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮，加入5μL连接液，轻轻摇匀，冰上放置30 min；42℃水浴热激70 s，冰上放置 2 min，加 LB培养基 400μL，200～250 rpm，37℃震荡培养1 h，室温下4 000 rpm离心5 min，弃去400μL上清液，用剩余的培养基重悬细胞，将细胞涂布在预先用100μL 20mg·mL-1X-gal和20μL 100 mM·L-1IPTG涂布的含有氨苄青霉素LB固体平板上。平板正向放置40min后倒置培养过夜。选择在IPTG-Xgal平板上生长的白色斑点，分别用无菌tip头挑取各转化子至含氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜。通过蓝白斑选择阳性克隆子，分别得到AOB与AOA的amo A基因克隆文库。

1.2.7 克隆文库的限制性长度多态性分析

利用引物M13-47（5′-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3′）和RV-M（5′-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3′）对克隆文库的插入片段进行 PCR扩增。扩增反应体系为：2.5μL 10× Reaction Buffer，0.5μL 10 mM dNTP，2μL 25 mM MgCl2，引物M13-47和RV-M各0.25μL，菌少许，Taq DNA聚合酶（5 U）0.25μL，补充ddH2O至25μL。PCR反应条件：94℃预变性 5 min；94℃预变性30 s；62℃变性30 s；72℃延伸90 s，30个循环；72℃最后延伸10min。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，2.0μg·mL-1EB染色10min后检测。

采用限制性内切酶MspⅠ和HinfⅠ对PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切分型。酶切反应体系为：MspⅠ0.3μL，HinfⅠ0.3μL，10×M Buffer 1μL，DNA 3μL，ddH2O 5.4μL。37℃恒温水浴10min，2%的琼脂糖凝胶电泳检测RFLP带型。

1.2.8 系统发育树的构建

通过分析RFLP带型图谱，选择克隆子进行测序。文库中将序列之间的相似性≥97%的序列作为一个操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU），基因序列Genbank数据库中进行BLAST序列比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），利用MEGA4.0软件中的邻接法构建系统发育树[16]。

2 结果和分析

2.1 龙凤湿地底泥理化参数分析

表1为大庆龙凤湿地底泥的理化参数，其pH达到9.1，呈弱碱性，且其盐分含量达到1.0%，说明大庆龙凤湿地有盐碱化。全氮的含量为2.61 mg·kg-1（以干样计，下同）。氨态氮与硝态氮的含量分别为3.86 mg·kg-1和16.87mg·kg-1，说明此湿地底泥为低氮环境。

表1 湿地底泥的理化参数Table 1 The physicochemical parameters ofwetland sediment

2.2 湿地底泥AOB的多样性与系统发育分析

根据各时期的OTU数与克隆子数绘制的AOB rarefaction曲线如图1。可以看出，AOB的rarefaction曲线趋于平稳，这说明所选取的克隆均具有很好的代表性，可以代表文库中大多数AOB的类型。

表2 湿地底泥AOB amo A基因序列统计结果Table 2 The statistical results of gene sequences on AOB amo A ofwetland sediment

基于湿地底泥中氨氧化细菌amo A基因构建的系统发育树如图3。所有的序列均属于Nirtosonomonas，与海洋亚硝化球菌（Nitrosococcus oceani）聚于进化树的不同分支。其中，LF-AOB-1在所有的克隆子中所占的比例为47.15%，与Liu等在河水泥沙中获得的序列（KF803085）相似率为99%。LF-AOB-2和LF-AOB-3分别与来自污水处理厂（JQ277647）和湿地沉积物（HQ202453）的序列聚在进化树的同一分支。

图1 湿地底泥中AOB克隆文库的rarefaction曲线Fig.1 Curve of AOB clone library ofwetland sediment rarefaction

图2 湿地底泥中AOA克隆文库的rarefaction曲线Fig.2 Curve of AOA clone library ofwetland sediment rarefaction

图3 基于amo A基因构建的AOB系统发育树Fig.3 Thephylogenetic treeofAOBbased on amo Agenesequences

2.3 湿地底泥AOA的多样性与系统发育分析

利用Arch-amo AF和Arch-amo AR对龙凤湿地底泥AOA的amo A基因扩增，得到大小约600 bp的条带。构建的amo A基因克隆文库经双酶切测序后得到3个OTU类型（97%相似率）（表3）。所有的序列与来自与河口沉积物等环境中的AOA amo A基因就有较高的相似性。

根据各时期的OTU数与克隆子数绘制的AOA rarefaction曲线如图2。可以看出，AOA的rarefaction曲线基本趋于平稳，这说明所选取的克隆均具有很好的代表性，可以代表文库中大多数AOA的类型。

表3 湿地底泥AOA amo A基因序列统计结果Table 3 The statistical results of gene sequences on AOA amo A ofwetland sediment

从AOA的amo A基因系统发育树来看（图4），所有的序列均属于不可培养的泉古菌门（Crenarchaeota）。其中，LF-AOA-1和LF-AOA-3分别与来自土壤和淡水湿地的序列聚在进化树的同一分支，其克隆子在文库中分别占11.6%和0.47%。LFAOA-2在所有的克隆子中所占的比例最高（83.7%），为底泥中AOA的优势菌属。

3 讨论

从AOB amo A基因克隆文库系统发育看到，本试验只检测到Nitromonas，并没有发现Nitrosospia，菌种类型较少，其与来自江河口沉积物和污水处理厂的序列均有较高的相似率。研究证明，在污水处理厂、人工湿地等pH较高的环境中通常能够检测到Nitrosomonas[17]。贺纪正等在封丘长期定点试验的碱性环境研究中也没有发现Nitrosospira的存在[18]，推测Nitrosospira偏爱于pH值较低的环境条件中生存，这与研究的结果相似。

研究发现AOA普遍存在于土壤[12]、河口沉积物、海水沉积物、陆地热泉口等自然环境中，这些研究结果预示着AOA在自然环境中的氮素循环中具有重要作用。本研究在龙凤湿地底泥中，同样证实AOA的存在，所获得的AOA amo A基因序列均属于泉古菌门（Crenarcharota）。有研究认为，与AOB相比，AOA更适合低浓度铵氮的环境条件，并且在此条件下的硝化作用中起主导作用[19]。Hatzenpichler等[11]认为AOA的生长能够受到高浓度铵的抑制。研究中的湿地底泥铵态氮浓度较低，有利于AOA的生长。AOA的发现改变了人们对传统氮素循环中氨氧化过程完全由AOB驱动的认识，而AOA与AOB对湿地底泥中氨氧化作用的相对贡献率还需要进一步深入研究。

图4 基于amo A基因构建的AOA系统发育树Fig.4 The phylogenetic tree of AOA based on amo A gene sequences

4 结论

（1）龙凤湿地底泥中得到3个AOB的OTU类型，所有的AOB的amo A基因序列均属于Nitromonas，未发现Nitrosospia的存在，这可能与此湿地底泥中较高的pH环境条件有关。

（2）龙凤湿地底泥中得到3个AOA的OTU类型，所有的AOA的amo A基因序列均属于Crenarcharota，与来自河口沉积物等环境中的序列具有较高的相似性，预示着AOA在人工干扰类型湿地生态系统的氮素循环过程中可能起重要的作用。

［1］Holt JG，Krieg N R，Sneath P H A.Ber Gey's Manual of Determinative Bacteriology ［M］.Baltimore（USA）：Williams and Wilkins，1994.

［2］Arp D J，Sayavedra-Soto L A，Hommes NG.Molecular biology and biochemistry of ammonia oxidation by Nitrosomonas europaea［J］.Archives of Microbiology，2002，178（4）：250-255.

［3］Rotthauwe J H，Witze K P，Liesack W.The Ammonia Monooxygenase structural gene amo A as a functional marker：Molecular fine-scale analysis of natural ammoniaoxidizing populations［J］.Applied and Environmental Microbiology，1997，63（2）：4704-4712.

［4］Kowalchuk G A，Naoumenko Z S，Derikx P J L，et al.Molecular analysis of ammonia-oxidizing bacteria of theβ subdivision of the class proteobacteria in compost and compostedmaterials［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65（2）：396-403.

［5］Siripong S，Rittmann B.Diversity study of nitrifying bacteria in full-scale municipal wastewater treatment plants［J］.Water Res，2007，41（5）：1110-1120.

［6］Kǒnneke M，Bernhard A E，Torre JD L，et al.Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon［J］.Nature，2005，437（7058）：543-546.

［7］Torre JD L，Walker C B，Ingalls A E，et al.Cultivation of a thermophilic ammonia oxidizing archaeon synthesizing crenarchaeol［J］.Environmental Microbiology，2008，10（3）：810-818.

［8］Agogue'H，Brink M，Dinasquet J，et al.Major gradients in putatively nitrifying and non-nitrifying Archaea in the deep North Atlantic［J］.Nature，2008，456（7223）：788-791.

［9］Karner MB，DeLong EF，Karl DM.Archaeal dominance in the mesopelagic zone of the Pacific Ocean［J］.Nature，2001，409（6819）：507-510.

［10］Hallam S J，Konstantinidis K T，Putnam N，etal.Genomic analysis of the uncultivated marine crenarchaeote Cenarchaeum symbiosum［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（48）：18296-18301.

［11］Hatzenpichler R，Lebedeva E V，Spieck E，et al.A moderately thermophilic ammonia-oxidizing crenarchaeota from a hot spring［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（6）：2134-2139.

［12］Chen X P，Zhu Y G，Xia Y，et al.Ammonia oxidizing archaea：important players in paddy rhizosphere soil［J］.Environ Microbiol，2008，10（1111）：1978-1987.

［13］孙志远，晏磊，王彦杰，等.牛粪堆肥高温期氨氧化古菌与氨氧化细菌的多样性分［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（6）：17-22.

［14］鲍士旦，秦怀英，史瑞和，等.土壤农化分析［M］.北京：中国农业出版社，2000.

［15］Wang X F，Wang W D，Gao L J，et al.Protocols of applification of denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）in studies of environmentalmicroorganism［J］.JournalofChina AgriculturalUniversity，2006，11（5）：1-7.

［16］Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Mol Biol Evol，2007，24（8）：1596-1599.

［17］Otawa K，Asano R，Ohba Y，et al.Molecular analysis of ammonia-oxidizing bacteria community in intermittent aeration sequencing batch reactors used for animal wastewater treatment［J］.Environ Microbiol，2006，8（11）：1985-1996.

［18］Shen J P，Zhang L M，Zhu Y G，et al.Abundance and composition of ammonia-oxidizing bacteria and ammonia -oxidizing archaea communities of an alkaline sandy loam［J］.Environmental Microbiology，2008，10（11）：1601-1611.

［19］刘晶静，吴伟祥，丁颖，等.氨氧化古菌及其在氮循环中的重要作用［J］.应用生态学报，2010，21（8）：2154-2160.