孟鲁司特对失血性休克复苏致急性肺损伤大鼠血清TNF-α、IL-6的影响及肺保护作用

田 刚，涂青梅，郑 敏，姜祯珍，罗兴均，赵 翔

(1. 湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000；2. 湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰 442000)

孟鲁司特对失血性休克复苏致急性肺损伤大鼠血清TNF-α、IL-6的影响及肺保护作用

田 刚1，涂青梅2，郑 敏1，姜祯珍1，罗兴均1，赵 翔1

(1. 湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000；2. 湖北医药学院附属太和医院，湖北 十堰 442000)

目的 观察孟鲁司特对失血性休克复苏致急性肺损伤大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的影响，探讨孟鲁司特的肺保护作用机制。方法 选取健康成年大鼠24只，随机分为3组：假手术组(Sham组)；失血性休克复苏致急性肺损伤模型组(HS组)和孟鲁司特治疗组(M组)，每组8只。除Sham组外，其余2组动物制备失血性休克复苏急性肺损伤模型。M组大鼠在放血前30 min给予孟鲁司特7 mg/kg腹腔内注射，在再灌注之前以同样的剂量再注射1次。Sham组和HS组均给予等量的乙醇溶液腹腔内注射。计算肺组织湿干质量之比(W/D)；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒定量测定血清TNF-α和IL-6含量；肺组织取样进行组织病理学检查。结果 与Sham组比较，HS组肺组织W/D明显增大(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6水平明显升高(P均<0.05)，肺组织病理改变为中度肺损伤。与HS组比较，M组肺组织W/D明显减小(P<0.05)，血清TNF-α、 IL-6水平明显降低(P均<0.05)，肺组织病理改变明显减轻，为轻度肺损伤。结论 孟鲁司特能够减轻失血性休克复苏大鼠血清TNF-α、IL-6水平的升高，从而减轻肺损伤，具有一定的肺保护作用。

失血性休克；急性肺损伤；孟鲁司特；肿瘤坏死因子α；白细胞介素-6

失血性休克(HS)是一种常见的并发症，由严重的外伤或手术创伤引起。失血性休克复苏(HSR)也被认为是一种损伤，因为它可以经常引起全身炎症反应综合征(SIRS)，结果可能会导致多脏器功能障碍综合征(MODS)，其中包括急性肺损伤(ALI)。ALI是临床医生面临的主要问题，导致发病率和病死率明显升高[1]。HS引起的SIRS的发病机制很复杂，与很多病理生理机制都有关系。目前被绝大多数人接受和认可的机制是缺血再灌注(I/R)以及对自身免疫细胞的刺激[2]。I/R是导致缺血复苏后氧化应激和SIRS发生的主要因素。中性粒细胞是参与HSR后急性肺炎的主要细胞因素。研究表明，HS后中性粒细胞被激活，并且中性粒细胞在肺内的积聚增加与肺损伤关系密切[3]。作为一种具有选择性和可逆性的半胱氨酰白三烯1(CysLT1)受体拮抗剂，孟鲁司特常被用于治疗过敏性鼻炎和哮喘[4]。通过中性粒细胞依赖机制，孟鲁司特可以改善发热和脓毒血症引起的多器官损害[5]。此外，由于其具有抗炎抗氧化作用，可减轻I/R引起的多种脏器如肝脏、肠、肾脏、睾丸和膀胱的氧化损伤。但孟鲁司特对HSR所致ALI的影响和作用尚少见文献报道。本研究旨在观察孟鲁司特对HS大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的影响，探讨孟鲁司特的肺保护作用机制，现报道如下。

1 实验资料

1.1实验动物与分组 选择成年健康SD大鼠(SPF级)24只，体质量200～250 g，雌雄不限，由湖北医药学院实验动物中心提供，合格证号：No.00031071。将其随机分为假手术组(Sham组)、失血性休克复苏致急性肺损伤模型组(HS组)、孟鲁司特治疗组(M组)，每组8只。Sham组：在相同的时间内接受相同的麻醉和手术过程成为休克动物，但既不是失血性休克也不进行液体复苏；HS组：经过心脏内穿刺缓慢放血1 h，失血量约为50%(30 mL/kg)，失血性休克后再用林格氏液复苏1 h，然后一直保留到实验结束；M组：在放血前30 min接受孟鲁司特7 mg/kg腹腔内注射，在再灌注之前以同样的剂量再注射1次。Sham组和HS组均给予等量的乙醇溶液腹腔内注射。

1.2HS模型的建立 用10%水合氯醛350 mg/kg经大鼠腹腔注射麻醉。从左侧胸部进行心脏内穿刺，放血时间2 min以上，放血量为50%(30 mL/kg),大鼠处于休克状态持续时间为1 h，之后通过尾部静脉输注乳酸林格氏溶液进行复苏，输液量为失血量的2倍(60 mL/h)，输液时间1 h以上。除了不放血和不复苏之外，Sham组进行所有的实验程序。整个实验过程中，大鼠均保持自主呼吸。复苏后2 h，大鼠被再次麻醉后从胸腔打开处放血处死，直接从心脏抽取血液样本。保留肺组织，右肺用于测定含水量；左肺用10%甲醛固定进行组织学检查。

1.3肺组织含水量测定 于以上时间点处死动物，开胸取右肺上叶，用吸水纸吸干表面水分及血液后称其质量，为湿质量，然后将其置于60 ℃烘箱中干燥72 h称其质量，为干质量，计算肺湿/干质量比(W/D)。

1.4血液样本的制备和炎性细胞因子检测 每只大鼠的心脏收集3 mL血液。血液取样在实验结束时进行(复苏完成后2 h)。血液样本凝固在37 ℃，然后以3 000 r/min离心15 min，分离血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒定量测定血清TNF-α和IL-6含量。

1.5组织取样及组织病理学检查 实验结束时，处死大鼠并取肺组织，用10%甲醛缓冲液立即固定所有组织病理学标本，进行常规处理，显微镜下观察部分标本的组织病理学改变。采用Matute-Bello等创立的评分系统对肺损伤程度进行评估。该评分系统对肺泡间质内充血、肺泡内细胞浸润以及肺泡出血进行分级，每项指标被分为0～3级。肺泡间质细胞分级：肺间质细胞稀少为0级；肺间质细胞<1/3视野为1级；肺间质细胞占据1/3～2/3视野为2级；肺间质细胞>2/3视野为3级。肺泡内细胞浸润：每视野肺泡内皮细胞<5个为0级；每视野肺泡内皮细胞5～10个为1级；每视野肺泡内皮细胞10～20个为2级；每视野肺泡内皮细胞>20个为3级。肺泡出血分级：没有出血为0级；1～5个肺泡中，每个肺泡至少5个红细胞为1级；5～10个肺泡中，每个肺泡至少5个红细胞为2级；>10个肺泡中，每个肺泡至少含5个红细胞为3级。单项指标得分相加，得到总的肺损伤评分。依据评分，肺损伤被分为3级：0分为正常，1～3分为轻度；4～6分为中度；7～9分为重度。组织学切片由病理科医生观察评估。

2 结 果

2.1各组大鼠肺组织含水量的变化 Sham组、HS组、M组W/D值分别为4.11±0.14，5.85±0.35，4.53±0.39，HS组、M组肺组织W/D值较Sham组明显增大(P<0.05)，M组较HS组比较明显减小(P<0.05)。

2.2各组大鼠血清TNF-α、 IL-6水平比较 与Sham组相比另两组大鼠血清TNF-α、IL-6水平明显升高(P<0.05)；与HS组相比，M组大鼠血清TNF-α、 IL-6水平明显降低(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比较

注：①与Sham组比较,P<0.05；②与HS组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠肺组织病理学分级情况比较 Sham组肺组织结构完整，肺间质无水肿、炎症肺泡大小形态均匀，见图1。HS组肺泡间隔水肿增厚，肺泡腔内有明显的出血、渗出，中性粒细胞浸润，见图2。M组肺泡间隔清晰，肺泡腔内的出血、渗出以及中性粒细胞浸润显著减轻。见图3。肺损伤评分显示，HS组中度肺损伤5只(62%)中重度肺损伤3只(38%)；M组大鼠肺损伤明显减轻，肺组织正常2只(25%)，轻度肺损伤5只(62%)，中度肺损伤1只(12%)。

图1 Sham组光镜下肺叶组织病理学改变(HE染色，×200)

图2 HS组光镜下肺叶组织病理学改变(HE染色，×200)

图3 M组光镜下肺叶组织病理学改变(HE染色，×200)

3 讨 论

目前的研究表明，HS会引起生化和组织学变化，从而导致ALI的发生[6]。孟鲁司特可以阻止HS后的生化改变，对肺组织有保护作用。白三烯与其他组织的I/R损伤关系密切，但是关于HS诱发的肺损伤与脂氧合酶5通路产物关系的研究目前还较少。

HS常导致SIRS，包括促炎细胞因子的系统性释放，而促炎细胞因子又是炎症反应的核心。之前的研究表明，创伤性失血发生后，体内IL-6和TNF-α的水平明显增高，且可以维持数小时[3]，这与Vincenzi等[7]的研究结果一致，他们也发现与假手术组相比，休克大鼠体内IL-6和TNF-α的水平显著增高。被激活的炎症细胞特别是巨噬细胞和中性粒细胞，已被证实在复苏性休克引起的SIRS的发生发展过程中扮演了关键角色，他们也是炎性细胞因子的主要来源，包括IL-6和TNF-α。Sener等[8]已证实，在肾脏I/R模型中，与诱导未治疗组相比，孟鲁司特明显降低了大鼠血浆中TNF-α和IL-6的水平。Maeba等[9]证实，通过抑制NF-κB激活，大剂量孟鲁司特可以调节IL-6和TNF-α的生成。CysLT受体阻滞剂可以抑制促炎细胞因子的产生，其中应用CysLT受体拮抗剂治疗，可明显减低IL-6水平。对脓毒血症引起的多器官损伤大鼠，孟鲁司特可以降低其血清中TNF-α的水平[5]。此外，Kabasakal等[10]研究表明孟鲁司特可以显著减少发热引起的氧化应激肠道损伤大鼠体内的TNF-α血清水平。本研究结果显示，与HS组相比，孟鲁司特可以明显降低HS大鼠体内IL-6和TNF-α水平，提示孟鲁司特对HS引起的ALI有保护作用。

形态学上，HS组总评分提示中度肺损伤，其中66%为中度肺损伤，33%为重度肺损伤。与HS组相比，孟鲁司特对大鼠的治疗明显减轻了肺损伤，M组的总评分提示轻度肺损伤。虽然没有数据表明孟鲁司特对HS大鼠肺实质有保护作用，但Sener等[11]证实孟鲁司特的治疗可以改善退化的肺上皮细胞，明显降低慢性肾衰竭引起的多器官损伤大鼠肺部炎症细胞的数量。此外，孟鲁司特可预防发热引起的肺损伤，因为其可以改善肺间质出血引起的大量肺泡结构紊乱和消失[12]。以I/R为模型的各种研究表明，孟鲁司特可以延缓不同器官的组织病理学变化，包括肝脏、肾脏和睾丸[5]。本研究中，孟鲁司特的抑制作用主要归因于其平衡氧化-抗氧化状态的能力以及减少促炎递质的产生，也可能抑制了中性粒细胞的激活和渗透。

综上所述，孟鲁司特能够降低HSR大鼠血清TNF-α、IL-6水平，从而减轻肺损伤，具有一定的肺保护作用。

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Effects of montelukast on serum TNF-α and IL-6 levels in rats with hemorrhagic shock followed by resuscitation induced acute lung injury and lung protective effect

TIAN Gang1，TU Qingmei2, ZHENG Min1，JIANG Zhenzhen1，LUO Xingjun1， ZHAO Xiang1

(1.Renmin Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China; 2.Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China)

Objective It is to investigate the effects of montelukast on serum TNF-α and IL-6 levels in rats with hemorrhagic shock followed by resuscitation induced acute lung injury and discuss montelukast lung protection mechanism. Methods Twenty-four normal rats were randomly divided into 3 groups(n=8 each): sham operation group (sham group), hemorrhagic shock followed by resuscitation group(HS group), montelukast treatment group (M group). Except the rats in sham group, rest rats were made into hemorrhagic shock followed by resuscitation models with lung injury. The rats in M group received a montelukast 7 mg/kg intraperitoneal injection 30 min before the induction of hemorrhagic shock, with the same dose repeated just before the reperfusion period. Both sham and HS group rats received the same volume of the ethanol carrier solution. The ratio of lung wet dry weight was calculated; quantitative determination of serum TNF-α and IL-6 was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit; lung tissue sampling was gotten for histopathological examination. Results The lung tissue W/D obviously increased, the TNF-α and IL-6 serum levels were significantly highe, lung tissue pathology change for moderate lung injury in the HS group when compared with the sham group (P<0.05). The lung tissue W/D obviously decreased, the TNF-α and IL-6 serum levels were significantly lower, lung tissue pathology change for mild lung injury in the M group when compared with the HS group (P<0.05). Conclusion Montelukast could significantly reduce the elevation of serum TNF-α and IL-6 levels in the hemorrhagic shocked rats, thus reduce the lung injury, which suggested that montelukast had a protective effect in haemorrhagic shock induced acute lung injury.

hemorrhagic shock； acute lung injury； montelukast； TNF-α； IL-6

田刚，男，硕士，副主任医师，研究方向为围术期器官保护。

郑敏，E-mail: lhj1286@163.com

湖北省十堰市科技攻关项目(2011066)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.02.005

R-332

A

1008-8849(2015)02-0129-04

2014-07-05