中药雀舌草中总黄酮提取纯化工艺优化

王小虎，邓振涛，图 雅，李泽琳，李 霄

(1. 北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124；2. 中国中医科学院，北京 100700)

中药雀舌草中总黄酮提取纯化工艺优化

王小虎1，邓振涛1，图 雅2，李泽琳1，李 霄1

(1. 北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124；2. 中国中医科学院，北京 100700)

目的 建立中药雀舌草总黄酮含量测定方法，并对其提取纯化工艺进行优化。方法 以芹菜素作为对照品，以三乙胺(TEA)为显色剂，在波长400 nm处对样品中的总黄酮含量进行测定，并以总黄酮含量为指标对其提取纯化工艺优化。结果 样品总黄酮在浓度30.56～83.14 μg/mL范围内线性关系良好，其回归方程为：Y=0.009 1X-0.016 1，R2=0.999 7；平均回收率为100.1%，RSD为1.95%(n=6)。雀舌草总黄酮纯化工艺为采用AB-8型大孔吸附树脂，上样浓度为0.25 g/mL生药材，上样流速为3 mL/min，径高比为1∶9，90%乙醇洗脱7倍量。结论 该方法简便、快速、准确、灵敏度高，可用于雀舌草中总黄酮含量控制；提取纯化工艺可用于雀舌草总黄酮的富集。

雀舌草；紫外分光光度法；总黄酮；工艺优化

中药雀舌草为石竹科植物雀舌草的全草，味微苦、酸、甘，性凉，具有祛风散寒、续筋接骨、活血止痛、解毒等功效，临床用于治疗伤风感冒、风湿骨痛、疮疡肿毒、跌打损伤、骨折、蛇咬伤[1]。现代研究表明，雀舌草含有丰富的黄酮类化学成分[2]，鉴于黄酮类化合物具有较多的药理活性，笔者应用紫外分光光度法建立了雀舌草总黄酮成分含量测定分析方法，并对雀舌草总黄酮提取纯化工艺进行优化，旨在为其质量控制及开发利用提供依据。

1 仪器与试剂

UV-2550紫外分光光度仪(日本岛津公司)；Millipore MilliQ 超纯水制备仪(LABCONCO公司)；METTLER AG 285型电子天平(1/10万，瑞士梅特勒公司)；KD-300DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Rotavapor R-200旋转蒸发仪(瑞士步琪BUCHI)。芹菜素对照品(批号：4YZ4-J793)，购自中国药品生物制品检定研究院；三乙胺(TEA)，北京化工分厂，分析纯；95%乙醇，北京化工分厂；其他试剂为国产分析纯；雀舌草药材购于安国市兴隆中药材有限公司，经北京中医药大学魏胜利副教授鉴定为石竹科植物雀舌草的全草；D4020、AB-8、X-5、S-8、D3520、H103等型号大孔吸附树脂均购自南开大学化工厂。

2 测定方法与结果

2.1对照品溶液的制备 精密称取芹菜素对照品50 mg，置于50 mL的容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容，即得芹菜素对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备 称取雀舌草药材粉末(粉碎过40目筛)0.5 g，精密称定，置于100 mL圆底烧瓶中，加入50%乙醇溶液50 mL，称质量，超声处理60 min，冷却至室温，称质量并用50%乙醇补充损失质量，混匀，静置30 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3显色方法与检测波长的选择 总黄酮类成分含量测定的显色方法主要有NaNO2-Al(NO3)2-NaOH显色法、AlCl3-KAc法、TEA法和直接测定法，经实验分别考察这4种显色方法对于测定雀舌草总黄酮的适用性，实验结果表明TEA法测定雀舌草总黄酮效果最好。加入TEA后，芹菜素最大吸收波长由340 nm红移到398 nm，雀舌草供试品由330 nm红移到400 nm，故选择400 nm作为实验测定波长。见图1及图2。

图1 芹菜素显色光谱图

图2 雀舌草供试品溶液显色光谱图

2.4线性关系考察 精密吸取芹菜素对照品溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL，置于10个10 mL容量瓶中加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1%TEA溶液2 mL，显色，随后用50%乙醇定容，摇匀，以加0.0 mL对照品溶液作为空白，在400 nm处检测其吸光度值。以吸光度值A为纵坐标，浓度C(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，结果见图3。得回归方程为Y=0.009 1X-0.016 1，R2=0.999 7；结果表明芹菜素在30.56～83.14 μg/mL范围内线性关系良好。

图3 芹菜素标准曲线

2.5精密度考察 取同一份雀舌草药材供试品溶液，精密吸取2 mL于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1% TEA溶液2 mL，随后用50%乙醇定容至刻度，摇匀，用分光光度计在波长400 nm处连续检测其吸光度值，测得其吸光度的RSD为0.1%(n=6)，结果表明仪器精密度良好。

2.6稳定性考察 取同一份雀舌草药材供试品溶液，分别在0，5，10，20，30，60，120，180，240 min，按2.4测定方法测定，测得其吸光度的RSD为0.7%，结果表明本品在室温条件下4 h内具有良好的稳定性。

2.7重复性考察 取同一批次雀舌草药材6份，按2.2项下供试品溶液制备方法制备，精密吸取供试品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1%三乙胺溶液2 mL，随后用50%乙醇定容至刻度，摇匀，用分光光度计在波400 nm处测定其吸光度值，测得每克雀舌草药材中平均含有总黄酮29.8 mg，其RSD为2.0%(n=6)，结果表明，测定方法重复性良好。

2.8加样回收率考察 取已知含量的雀舌草药材粉末6份，约0.2 g，精密称定，置于100 mL圆底烧瓶中，并精密加入芹菜素对照品溶液6 mL，按2.2项下供试品制备方法制备，精密吸取供试品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1% TEA溶液2 mL，随后用50%乙醇定容至刻度，摇匀，用分光光度计在波长400 nm处测定其吸光度值，计算回收率和RSD。结果见表1。

表1 加样回收率考察

2.9雀舌草药材中总黄酮含量测定 取雀舌草药材3份，按2.2项下供试品制备方法制备，精密吸取供试品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1% TEA液2 mL，随后用50%乙醇定容至刻度，摇匀，用分光光度计在波长400 nm处测定其吸光度值。计算其总黄酮含量。结果见表2。

表2 药材中总黄酮含量测定结果

3 提取工艺优化与结果

3.1正交试验 采用4因素3水平正交试验法来设计提取工艺，主要因素为提取溶剂(A)、提取时间(C)、提取次数(B)及溶剂倍量(D)，因素水平及正交试验方案见表3。

表3 提取工艺L9(34)因素水平

3.2正交试验结果 称取雀舌草药材20 g共18份，其中每2个为一组平行实验，加入到1 000 mL的圆底烧瓶中，水浴加热回流，按L9(34)表3中各因素水平表进行操作，分别制备各样品，趁热纱布过滤，提取液冷却后摇匀后取样作为样品溶液，精密吸样品溶液150 μL，置于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1% TEA溶液2 mL，显色，随后用50%乙醇定容，摇匀，再用紫外分光光度计在400 nm下检测吸光度，检测雀舌草提取液中总黄酮含量，真空干燥，称质量，计算干膏含量和得率。正交试验结果表明，以雀舌草总黄酮为指标测定，提取次数对雀舌草总黄酮成分的提取量有显著影响；由方差分析可以看出，对雀舌草总黄酮的提取量影响大小为B>D>C>A，且其最佳工艺为A2B3C3D2，即提取溶剂为50%乙醇溶液15倍量，回流提取3次，每次2h。见表4及表5。

表4 提取工艺L9(34)正交试验结果

表5 提取工艺正交试验方差分析

注：F0.05(2.2)=4.26，P<0.05。

4 纯化工艺优化与结果

4.1样品溶液的制备 称取雀舌草药材1kg，切段，过筛，以15倍量的50%乙醇加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液并浓缩至2 000 mL，即得提取液(每1 mL相当于药材0.5 g)，备用；另取提取液50 mL减压干燥，经测定，提取液中总黄酮的含量为6.4 mg/mL，干膏中总黄酮含量为6.3%。

4.2AB-8大孔吸附树脂纯化工艺优化 取AB-8型大孔吸附树脂约20 g，装入层析柱(内径为1.5 cm、高20 cm)中，径高比为1∶9。另取雀舌草提取液稀释5倍(浓度为1 mL相当于0.1 g药材)，取160 mL上样，上样流速为1.0 mL/min，分份收集流出液，前60 mL每5 mL收集1份，后100 mL每10 mL收集1份，共收集22份，按2.4项下雀舌草总黄酮含量测定方法测定每份泄漏液中雀舌草总黄酮量。以总黄酮泄漏量为纵坐标，以上样药液体积为横坐标绘制泄漏曲线，见图4。结果可见，雀舌草提取液上样15 mL时开始泄漏，上样50 mL后树脂吸附完全饱和。

图4 总黄酮泄漏曲线

4.3药材量与树脂体积比例考察 取3根相同型号的层析柱(内径为1.5 cm、高20 cm)，按径高比1∶9装入AB-8型大孔树脂，树脂量约20 g，体积约为24 mL。根据泄漏体积分别选取15 mL、20 mL、25 mL上样，上样药液浓度为0.1 g生药/mL(浓度为1 mL相当于0.1 g药材)，即药材量与树脂体积比分别为1∶16，1∶12，1∶9.6，上样流速均为1.0 mL/min，上样后分别用去离子水5倍量洗脱，收集水洗液；再用70%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集醇洗液，回收溶剂，减压干燥，称质量，按2.4项下雀舌草总黄酮含量测定方法检测水洗液和醇洗液中总黄酮的量，计算总黄酮的泄漏量、泄漏率、干膏含量和洗脱率，结果药材量与树脂体积的最佳比例为1∶9.6，最大上样量为25 mL。见表6。

4.4上样浓度、上样流速、径高比考察

4.4.1正交实验表设计 采用L9(34)不重复正交试验，以雀舌草总黄酮含量为指标对上样浓度(A)、上样流速(B)、径高比(C)进行考察。正交因素水平见表7。

表6 药材量与树脂体积比例考察

4.4.2正交结果分析 取9根同一型号的层析柱(内径为1.5cm，高20cm)，另取雀舌草提取液，并分别稀释成浓度为0.1，0.25，0.5 g/mL的药液，按上样量与树脂体积比1∶9.6上样吸附，并按表7中各因素水平进行操作，用去离子水5倍量洗脱，70%乙醇6倍量洗脱，收集洗脱液，按2.4项下雀舌草总黄酮含量测定方法测定树脂残夜、水洗液、醇洗液总黄酮含量，计算洗脱率、干膏含量和得率，正交试验结果表明，以雀舌草总黄酮含量为指标测定，上样浓度对树脂纯化后雀舌草总黄酮的含量有显著性影响；由方差分析可以看出，对雀舌草总黄酮的提取量影响因素大小为C>A>B，且其最佳工艺为A2B3C3，即上样浓度为0.25 g/mL生药材，上样流速为3 mL/min，径高比为1∶9。见表8和表9。

表7 纯化工艺L9(34)因素水平

表8 纯化工艺L9(34)正交试验结果

表9 纯化工艺正交试验方差分析

注：F0.1(2，2)=4.26，P<0.05。

4.5洗脱溶剂的考察 取3根相同的层析柱按照上述优化的树脂条件装柱上样后，分别用50%，70%，90%乙醇洗脱7BV，收集醇洗液，回收溶剂，减压干燥，称量干膏质量，按2.4项下雀舌草总黄酮含量测定方法分别测定醇洗液中的总黄酮含量，计算洗脱率及干膏含量。结果为用90%乙醇洗脱7倍保留体积最好，洗脱率较高，而且干膏含量也较稳定。见表10。

4.6纯化工艺验证实验 取3根相同的层析柱按照上述优化的树脂条件制备3批样品，上样液均为7 mL(每1 mL相当于0.25 g生药材)，分别收集醇洗液，回收溶剂，减压干燥，称量干膏质量，按2.4项下雀舌草总黄酮含量测定方法分别测定干膏中总黄酮含量，测得纯化后雀舌草干膏中总黄酮含量为56.9%，比纯化前提高了9倍。

5 讨 论

黄酮类化学成分是中药及天然产物中最常见而且活性较强的一类化学成分，关于总黄酮的测定方法多为分光光度法和HPLC法[3-5]，以芦丁为对照品测定的文献较多[6-8]。但是值得注意的是，不同的药材、不同的黄酮结构类型具有特殊性，不能一概以芦丁为对照品，而是要根据测定药材的黄酮结构类型进行实际考察，找出合适的测定方法。本研究结果显示，芹菜素及供试品溶液经显色后均在400 nm处有最大吸收波长，可见以芹菜素作为雀舌草的对照品，对其总黄酮含量测定更为准确。紫外检测法测定总黄酮准确、稳定可靠，成本低廉，仍为一种控制中药质量的重要方法。

正交试验表明对雀舌草总黄酮提取量的影响因素中，提取次数>提取倍量>提取时间>提取溶剂，且其最佳工艺为50%乙醇溶液15倍量，回流提取3次，每次2 h。

应用AB-8型大孔吸附树脂对雀舌草总黄酮进行富集，通过正交试验等确定其最佳纯化工艺为上样浓度为0.25 g/mL生药材，上样流速为3 mL/min，径高比为1∶9，90%乙醇洗脱7倍量。

表10 洗脱溶剂浓度考察数据

[1] 谢宗万.全国中草药汇编[M].北京：人民卫生出版社，1975

[2] 周荣汉. 药用植物化学分类学[M]. 上海：上海科学技术出版社，2005

[3] 赵继明. 枸杞子不同提取物中总黄酮含量比较[J]. 现代中西医结合杂志，2012，21(6)：647-648

[4] 池玉梅，居羚，邓海山，等. 分光光度测定总黄酮法的适用性[J]. 分析化学，2010，38(6)：893-896

[5] 刘计权，谢树莲，蔡瑾，等. UV和HPLC测定草问荆总黄酮及山柰素含量[J]. 山西大学学报，2011，34(3)：480-484

[6] 张琳琳，祁峰，缪阳，等. 亳菊总黄酮类提取工艺的研究[J]. 现代中西医结合杂志，2013，22(27)：3063-3065

[7] 张吉祥，白晓杰，周秋香，等. FL-2大孔吸附树脂对山楂总黄酮的分离纯化研究[J]. 北京中医药大学学报，2009，32(1)：62-64

[8] 袁王俊，张维瑞，吴宏欣，等. HPLC法测定柴胡不同部位4种黄酮类成分[J]. 中成药，2013，35(4)：797-800

Quantification of total flavonoids in Stellaria alsine and its extraction-purification process optimization

WANG Xiaohu1, DENG Zhentao1, TU Ya2, LI Zelin1, LI Xiao1

(1.College of Life Science & Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 2. China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

Objective It is to establish UV method for the quantification of total flavoids in Stellaria alsine, and optimize its extraction and purification process. Methods UV quantification for the samples was carried out with apigenin as reference and TEA as Chromogenic agent. The detection wavelength was 400 nm. Results The calibration curve of total flavonoids was linear over the range from 30.56 to 83.14 μg/mL (R2=0.999 7), regression equation wasY=0.009 1X-0.016 1, and the average recovery was 100.1%. The relative standard deviation was 1.95%. And the AB-8 type of resins was selected by indicative constituents apigenin. The best purified technological parameter was the sample concentration was 0.25 g/mL, the absorptive flow rate was 3.0 mL/min, the ratio of diameter and height was 1∶9, and the eluant was 7 volume of 90% ethanol. Conclusion The UV method was simple, rapid, accurate and specific and suitable for quality control of total flavonoids in Stellaria alsine, and the optimization process can be used for enrichment total flavonoids from Stellaria alsine Grimm.

Stellaria alsine；total flavoids；UV spectrophotometry；process optimization

王小虎，男，在读硕士生，主要从事中药及天然药物药效物质基础与质量控制研究。

李霄，硕士生导师，E-mail：lixiao@bjut.edu.cn

北京市教委资助项目(JC015001201201)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.02.002

R284.3

A

1008-8849(2015)02-0118-05

2014-07-10